張 順 廖 健 柏 琴 陳 沖 郭昱嵩 劉楚吾 王中鐸

(廣東海洋大學(xué) 南海水產(chǎn)經(jīng)濟動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點實驗室 湛江 524025)

紅樹林生態(tài)系統(tǒng)(Mangrove ecosystem)是近海三大生態(tài)系統(tǒng)之一, 多分布于海陸交界的河口區(qū), 受潮汐影響明顯, 生態(tài)環(huán)境變化多樣, 不僅物種多樣性極其豐富(Field et al,1998), 還具有凈化溫室氣體、抵抗水污染等重要的功能(Li et al, 2014), 國內(nèi)外已有廣泛的研究(張喬民等, 2001; Castellanos-Galindo et al,2013)。紅樹林因其獨特的根部結(jié)構(gòu)以及豐富的藻類等食物資源而成為魚類理想的棲息地(Blaber, 2007;Gajdzik et al, 2014)和育幼場(Kimirei et al, 2013)。Nickerson(1999)研究表明, 美國、印度等地區(qū)60%以上的魚類在其一生的發(fā)育過程中與紅樹林密切相關(guān)。我國雷州半島擁有紅樹林及其附近灘涂面積約20279hm2, 是國家級紅樹林重點保護(hù)區(qū)之一。近些年來, 人口不斷增加, 環(huán)境的惡化以及加上人為的過度開發(fā), 致使原本生態(tài)環(huán)境比較脆弱的紅樹林生態(tài)系統(tǒng)逐漸被破壞, 近海漁業(yè)資源日漸枯竭。據(jù)“我國近海海洋綜合調(diào)查與評價”顯示, 近半個世紀(jì)以來, 我國紅樹林濕地喪失近 73%, 由 55萬 hm2減至 15萬hm2(謝慶裕, 2012)。通過相關(guān)學(xué)者對我國廣東(Han et al, 2003)、廣西(黃德練等, 2013)、臺灣(Kuo et al, 1999)等地紅樹林的調(diào)查結(jié)果表明, 自紅樹林劃入自然保護(hù)區(qū)后, 我國紅樹林濕地的物種多樣性有所提升, 但相比鼎盛時期依然存在較大差距, 需要進(jìn)一步研究和保護(hù)。

近年來, 世界魚類數(shù)據(jù)庫FishBase (http://fishbase.org/)已被廣泛應(yīng)用于魚類形態(tài)學(xué)鑒定, 由于魚類棲息環(huán)境變化大, 性狀特征變異快, 及各區(qū)域研究水平不一, 單一的形態(tài)學(xué)分類法作為基本的分類法存在諸多的局限性。隨之, DNA條形碼(DNA barcodes)作為一個標(biāo)準(zhǔn)化和世界通用的物種識別系統(tǒng)被 Hebert等(2003)提出, 即通過使用短的、標(biāo)準(zhǔn)化的基因片段來進(jìn)行物種鑒定, 成為了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類的輔助工具(Hajibabaei et al, 2007)。Ward 等(2005)用 COⅠ基因(Cytochrome c oxidase subunit)Ⅰ中的655bp片段對澳大利亞207種海洋魚類進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)所有物種都能被有效地區(qū)分, 通過重建系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 認(rèn)為COⅠ作為海洋魚類的 DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列是可行的。王中鐸等(2009)用COⅠ基因?qū)δ虾Ｓ补囚~類40個物種89個樣本進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明COⅠ序列廣泛適用于硬骨魚類的物種鑒別, 并可用于低級分類階元的系統(tǒng)進(jìn)化分析。DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于物種多樣性的評價也有廣泛的研究(Swartz et al, 2008;Triantafyllidis et al, 2011)。本文將形態(tài)學(xué)分類法與DNA條形碼相結(jié)合應(yīng)用于紅樹林魚類物種的分類鑒定, 分析魚類生態(tài)類群組成的特點, 以探討紅樹林生態(tài)系統(tǒng)作為魚類棲息地和育幼場的功能, 同時進(jìn)一步完善該區(qū)域魚類的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與形態(tài)學(xué)鑒定

2014年3月至2015 年7月于雷州半島紅樹林海域 (廉 江 高 橋 (109°47′E, 21°36′N)、 雷 州 流 沙 灣(109°56′E, 20°26′N)、霞山東海島(110°20′E, 20°6′N)、遂溪九龍山(110°17′E, 20°39′N))共采集成魚和幼魚樣本1720尾, 每月采用圍網(wǎng)、地籠、拖網(wǎng)以及 200目的手抄網(wǎng)進(jìn)行隨機采集。依據(jù)Fish Base數(shù)據(jù)庫等魚類形態(tài)分類系統(tǒng)(伍漢霖等, 2008)初步確認(rèn)存在94個物種, 最終參考《拉漢世界魚類系統(tǒng)名典》(伍漢霖等,2012)和綜合分類學(xué)信息系統(tǒng)(Integrated Taxonomic Information System, ITIS)對物種的有效名以及分類地位進(jìn)行確定。取背部肌肉組織提取DNA, 剩余樣品用95%的乙醇固定, –40°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA的提取、PCR擴增及測序

取約 0.2g魚的肌肉經(jīng) Protease K消化后, 參考《分子克隆實驗指南》的酚/氯仿抽提法(薩姆布魯克等,2008), 提取 DNA。COⅠ基因序列擴增引物(Ward et al, 2005): Fish F: 5′-TCAACC AACCACAAAGACAA TGGCAC-3′; Fish R: 5′-TAG ACTTCTGGGTGGCC AAAGAATCA-3′。PCR 反應(yīng)總體積為 25μL, 包括2.5μL 10×Buffer, 2.0μL dNTP (2.5 mmol/L), 上下游引物各 1μL (5μmol/L), 0.2μL Taq DNA聚合酶(5U/μL),0.5—2.0μL模板 DNA, 超純水補齊。PCR反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為: 94°C 預(yù)變性 3min; 94°C 變性 30s、55°C 退火 30s、72°C延伸 50s, 共 30個循環(huán); 最后 72°C延伸5min, 最后, 4°C下保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后, 委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.3 物種鑒定與序列分析

利用 BioEdit軟件對獲得的堿基序列檢測后, 導(dǎo)入NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫和BOLD (The Barcode of Life Data System)系統(tǒng)進(jìn)行序列相似度比對, 并結(jié)合魚類形態(tài)學(xué)資料進(jìn)行輔助鑒定, 確保其準(zhǔn)確性。通過 MEGA6.0軟件分析 COⅠ基因序列特征及序列間的遺傳距離。利用DNAsp5軟件(Rozas et al, 1999)計算種間平均核苷酸差異數(shù)(K)及單倍型分析。選用 Kimura 2-parameter(K2P)計算遺傳距離, 鄰接法(Neighbor-Joining method, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 經(jīng) 1000次重復(fù)抽樣(Bootstraps)檢測分子系統(tǒng)樹分枝的置信度。

1.4 魚類生態(tài)類群的組成分析

依據(jù)Elliott等(2007)建立的魚類生態(tài)類群分類方法, 并結(jié)合描述魚類生活史特征的其它相關(guān)資料, 將紅樹林魚類分為海洋偶見魚類(marine stragglers,MS)、海洋洄游魚類(marine migrants, MM)、紅樹林定居魚類(estuarine species, ES)、溯河洄游魚類(anadromous, AN)、降海洄游魚類(catadromous, CA)、淡水洄游魚類(freshwater migrants, FM)、淡水偶見魚類(freshwater stragglers, FS)、兩側(cè)洄游魚類(amphidromous, AM)八類。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 COⅠ序列特征及序列間遺傳距離分析

利用COⅠ條形碼輔助形態(tài)分類法進(jìn)行物種鑒定,獲得115條有效長度約為560bp的堿基序列, 未存在插入和缺失。由表1可得知, A+T堿基含量(54.1%)高于 G+C含量(45.9%), 表現(xiàn)出 A+T堿基組成偏向性;第 1密碼子位點的 G+C含量(55.1%)高于第 2和第3密碼子位點(42.8%和 39.6%), 密碼子組成也表現(xiàn)出一定的偏倚性。從總體來看, 含有295個多態(tài)位點, 約占52.7%, 簡約信息位點數(shù)為 265個(約占47.3%), 轉(zhuǎn)換/顛換之比為 1.56, 說明序列突變已達(dá)到飽和; 種間平均核苷酸差異數(shù)為49, 約占總核苷酸數(shù)的29.17%。

由各分類階元K2P遺傳距離(表2)可知, 種內(nèi)不同個體的遺傳距離平均為0.0032, 而同屬不同物種間的遺傳距離為0.0562, 約為種內(nèi)遺傳距離的17倍, 符合 Hebert等(2003)提出的“10×規(guī)則”。種間遺傳距離在同科不同屬間平均為 0.1432, 而同目不同科間為0.2115, 可見, K2P遺傳距離值在科以上的高級階元的增加明顯變緩。此外, 蝦虎魚科與笛鯛科、鯔科和鯡科兩兩間平均遺傳距離變化范圍在0.2331—0.2534,科間的遺傳距離變異較小。

表1 94種魚類的COⅠ基因序列堿基組成及變異情況Tab.1 Base composition and variation of all CO Ⅰ gene sequences of 94 fish species

表2 各分類階元遺傳距離(K2P)統(tǒng)計表Tab.2 Genetic divergence (in K2P) within various taxonomic levels

2.2 物種的鑒定及有效種名的確定

經(jīng)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定, 94個物種分屬于11目33科72屬, 其最終的物種有效名、分類地位及生態(tài)類群見表 3。研究發(fā)現(xiàn), 存在多種魚類形態(tài)變異較小, 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)難以鑒別, 最后通過形態(tài)學(xué)鑒定到屬而未能確定其物種名的有 12 個物種(以“*”或“**”表示)。

由于形態(tài)學(xué)分類法存在一定的局限性, 再將所獲取的COⅠ基因序列導(dǎo)入到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫和BOLD系統(tǒng)進(jìn)行序列相似度比對, 其中59種魚類形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果與兩者比對結(jié)果相對應(yīng)(Ident≥98%)。存在13種魚類形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果僅與NCBI數(shù)據(jù)庫相似度最高的比對結(jié)果相對應(yīng), 而與 BOLD系統(tǒng)未能高度匹配(“△”標(biāo)注), 6種魚類形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果僅與BOLD系統(tǒng)相似度最高的比對結(jié)果相對應(yīng)(“”▽標(biāo)注)。研究發(fā)現(xiàn), 數(shù)據(jù)庫中與形態(tài)鑒定為彈涂魚(P.modestus)一致性最高的序列為尾斑舌塘鱧(Parioglossus dotui) (Ident≥99%), 但后者形態(tài)特征與分布情況同該魚種差距甚大, 因此將該樣本確定為彈涂魚(“§”標(biāo)注)。另外, 12個物種通過形態(tài)學(xué)可鑒定到種, 分子鑒定到科的有8種(以“*”表示), 分子鑒定到屬的為 4種(以“**”表示), 說明數(shù)據(jù)庫里的物種DNA條形碼不夠完善, 亟需補充。此外, 通過綜合比較物種的有效命名和分類地位, 發(fā)現(xiàn)6個物種存在分歧, 本文最終以《拉漢世界魚類名典》和綜合分類學(xué)信息系統(tǒng)的信息為準(zhǔn)(“”☆標(biāo)注)。

2.3 魚類群落組成

本次于雷州半島紅樹林保護(hù)區(qū)共采集到魚類 94種, 其中鱸形目魚類有59種, 占總物種數(shù)的62.77%,其次是鯡形目和鯔形目分別為6種(占6.38%)和5種(占 5.32%), 而鯉形目的魚類采集到 2種(占 2.13%),鱸形目中種類最多的科是蝦虎魚科, 29種(占 30.85%),其次是鯛科有6種(占6.38%)?？赡苁怯捎谖r虎魚類絕大多數(shù)體型細(xì)小, 更適宜于紅樹林濕地生態(tài)環(huán)境, 成為了代表性物種。

從生態(tài)類群組成來看(圖 1), 紅樹林海域物種數(shù)占優(yōu)勢的是海洋洄游魚類, 共有 31種, 占物種總數(shù)的32.98%, 其次是海洋偶見魚類21種(占22.34%)和兩側(cè)洄游魚類 16種(占 17.02%), 而紅樹林定居魚類10種, 占物種總數(shù)的10.64%, 其次是淡水偶見魚類6種和淡水洄游魚類8種, 而采集到的降海洄游魚類有1種, 為日本鰻鱺(A. japonica), 溯河洄游魚類為1種,為暗紋多紀(jì) 鲀 (T. porphyreus)。研究發(fā)現(xiàn), 四個采集點的各生態(tài)類群組成具有相似的特征, 以海洋洄游魚類為優(yōu)勢種群, 以海洋偶見魚類、紅樹林定居魚類、兩側(cè)洄游魚類居多。流沙灣和東海島的海洋偶見魚類物種數(shù)明顯多于九龍山和高橋; 僅各1種的溯河洄游魚類和降海洄游魚類分別出現(xiàn)于流沙灣和東海島; 東海島的兩側(cè)洄游魚類少于另外三個采樣點。

表3 94種魚類的物種名錄、生態(tài)類群及相應(yīng)DNA條碼序列號Tab.3 The list of 94 fish species, ecological groups and the corresponding DNA GenBank accession numbers

續(xù)表

續(xù)表

2.4 聚類分析

圖1 雷州半島各采樣點的物種數(shù)及各生態(tài)類群的百分比組成Fig.1 Composition of fish species and ecological groups of each site in Leizhou Peninsula

圖2 雷州半島紅樹林94個物種的115條COⅠ序列構(gòu)建的鄰位連接樹Fig.2 The neighbor-joining tree of 115 CO Ⅰ barcoding sequences of 94 species in mangrove waters of Leizhou Peninsula

基于115條COⅠ序列的101個單倍型構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹, 同種魚類的不同個體間均可各自聚為獨立的一支, 且屬內(nèi)不同物種間界限清晰(如圖 2)。蝦虎魚科(Gobiidae)的彈涂魚屬(Periophthalmus)、青彈涂魚屬(Scartelaos)聚為一支, 與蝦虎魚科(Gobiidae)的背眼蝦虎魚屬(Oxuderces)及其它的屬親緣關(guān)系很近(以◆表示), 從而可以進(jìn)一步證實經(jīng)數(shù)據(jù)庫相似度比對高的物種并非尾斑舌塘鱧(Parioglossus dotui),而是彈涂魚(P. modestus)。另外, 鲀形目(Tetraodontiformes)(以▲表示)及鯔科(Mugilidae)的鯔屬(Chelon)(以○表示)也能各自聚為獨立的一支, 且置信度高。其中, 庇 隆氏擬單角 鲀 (P. peroni)與同屬于四齒 魨 科(Tetraodontidae)的其它魚類聚類關(guān)系較遠(yuǎn), 黑翼 文 鰩 魚(H. rondeletii) 與 同 屬 于 鶴 鱵 目(Beloniformes)(以□表示)的其它魚類聚類關(guān)系較遠(yuǎn),此外, 一些目內(nèi)科屬間的聚類關(guān)系出現(xiàn)一些異常, 即鲉形目(Scorpaeniformes)、鰈形目(Pleuronectiformes)(分別以■和◇表示)的物種與其它目的聚類關(guān)系比較混亂。

3 討論

紅樹林同海草床和珊瑚礁海域存在相通性, 是魚類重要的棲息地和育幼場, 研究其魚類的種類對于保護(hù)物種多樣性具有極其重要的作用(Honda et al,2013)。由于紅樹林中魚類棲息環(huán)境變化大, 性狀特征變異快及存在隱存種、新物種和雜交種(Zemlak et al,2009)等問題加大了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類鑒定的難度。本研究將COⅠ條形碼應(yīng)用于雷州半島沿岸紅樹林魚類的分類鑒定, 提高物種鑒定的準(zhǔn)確性及有利于推動DNA條形碼數(shù)據(jù)庫共享平臺的建設(shè), 同時也揭示出了一些問題。

3.1 應(yīng)用COⅠ條形碼進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)的問題

應(yīng)用 COⅠ條形碼鑒別出紅樹林魚類共計 94種,由此可見其作為通用引物的廣泛適用性及其優(yōu)勢。但由于 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫仍有欠缺, 本研究的魚類樣品中仍有一些物種未能進(jìn)行分子鑒定, 以及由于時間久遠(yuǎn)和鑒定方法不夠完善, 有的后期研究結(jié)果未及時更新至數(shù)據(jù)庫。建議需加強標(biāo)本資料的收集及進(jìn)一步完善 DNA條形碼數(shù)據(jù)庫, 推動國際數(shù)據(jù)庫共享平臺的建設(shè)。另有研究指出單一的COⅠ基因并非適用于所有魚類物種的鑒別(Krück et al, 2013)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)了廣泛培育雜交種及近海外來物種的侵襲等新的問題, 加大了研究難度, 新的研究工具 “多基因條形碼”應(yīng)加大研究和應(yīng)用(Chesters et al, 2015),并及時補充低分化物種的其它相關(guān)數(shù)據(jù)(如線粒體DNA控制區(qū)等)進(jìn)行更進(jìn)一步的分析。

3.2 紅樹林對于不同生態(tài)類群魚類的保育意義和生境危機

紅樹林區(qū)采集的鯉形目(Characiformes)魚類有 2種(占 2.13%)與何秀玲等(2002)對雷州半島紅樹林區(qū)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)的鯉形目魚類占總物種數(shù)的 3.90%近似,但遠(yuǎn)低于長江口潮溝的優(yōu)勢類群鯉形目(占物種總數(shù)14.94%)(金斌松, 2010), 這可能是由于長江口的徑流量較雷州半島紅樹林河口的徑流量大, 更適宜于鯉形目魚類的生存。由生態(tài)類群分析來看, 紅樹林海域的物種數(shù)占優(yōu)勢的是海洋洄游魚類、海洋偶見魚類和兩側(cè)洄游魚類, 其特征同金斌松(2010)研究的長江口鹽沼潮溝魚類的生態(tài)類群組成相似, 表明紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是許多海水、淡水和洄游性魚類在特定生活階段的重要棲息地和育幼場所, 且與已有的紅樹林調(diào)查一致(Elliott et al, 2007; Franco et al, 2008; 黃德練等, 2013)。紅樹林采集到的10種定居魚類, 占物種總數(shù)的 10.64%, 主要是蝦虎魚類, 其依靠特化的生理構(gòu)造, 比其它類型魚類更能適應(yīng)鹽度波動、潮汐漲落等復(fù)雜多變的紅樹林生態(tài)環(huán)境, 成為了代表性物種。

3.3 COⅠ條形碼在系統(tǒng)進(jìn)化分析中的適用性和局限性

系統(tǒng)關(guān)系樹中的同種魚類的不同個體間均可各自聚為獨立的一支, 且屬內(nèi)不同物種間界限清晰, 但對于科以上的聚類關(guān)系分析不是很清晰, 如鲉形目(Scorpaeniformes)、鰈形目(Pleuronectiformes)的物種與其它目的聚類關(guān)系比較混亂, 表明 COⅠ條形碼具備一定的低階元系統(tǒng)進(jìn)化分析能力, 但對于高級階元的系統(tǒng)進(jìn)化分析準(zhǔn)確性明顯降低。究其原因, 可能是 COⅠ條形碼序列長度僅約 560bp, 信息位點數(shù)目有限, 科間變異較大, 且在高級階元時堿基置換趨于飽和, 這與COⅠ條碼序列間K2P遺傳距離值在種以上的高級階元的增加明顯變緩的特征相符合。

為了獲得較為準(zhǔn)確的物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系, 構(gòu)建比較客觀的進(jìn)化樹, 可以選擇 mtDNA不同區(qū)域的多組序列的組合比較的途徑; 或選擇核 DNA序列和mtDNA不同區(qū)域相結(jié)合的方法; 或選擇整個mtDNA全序列來進(jìn)行研究的方法。近年來, 這些方法也得到過驗證(Rocco et al, 2007; Keskin et al, 2009; Catanese et al, 2010)。此外, 研究發(fā)現(xiàn), 庇 隆氏擬單角 鲀 (P.peroni)與同屬于四齒魨科(Tetraodontidae)的其它魚類聚類關(guān)系較遠(yuǎn), 黑翼文鰩魚(H. rondeletii)與同屬于鶴 鱵 目(Beloniformes)的其它魚類聚類關(guān)系較遠(yuǎn), 在一定程度上說明了這兩種魚類目前的分類地位有待進(jìn)一步的商議。

綜上所述, 本文利用 COⅠ條形碼技術(shù)可有效快捷地鑒定出紅樹林海域的魚類并發(fā)現(xiàn)物種多樣性極其豐富, 紅樹林生態(tài)系統(tǒng)更是許多淡水、海水和洄游性魚類的重要棲息地和育幼場所。雖然COⅠ條形碼在屬內(nèi)的同物種間界限清晰, 但對于科以上的聚類關(guān)系分析不是很清晰, 說明其具備一定的低階元系統(tǒng)進(jìn)化分析能力, 但對于高級階元的系統(tǒng)進(jìn)化分析準(zhǔn)確性有所降低, 其原因與序列長度較短有關(guān), 對于高階元系統(tǒng)關(guān)系分析, 應(yīng)該加強對“多基因條形碼技術(shù)”的研究, 更加準(zhǔn)確的確定物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和分類地位。由于采樣方法的限制以及近海生態(tài)環(huán)境的多變, 對組成生態(tài)類群的魚類樣本采集不夠全面, 并且加上人類的過度捕撈, 導(dǎo)致近海漁業(yè)資源的枯竭,給研究工作帶來了一定的困擾。支持 Thomsen等(2012)提出的可以嘗試?yán)?DNA條形碼來檢測水體中的體表細(xì)胞或分泌物來研究魚類的種群分布和活動范圍, 使條形碼技術(shù)成為魚類遷徙、洄游等相關(guān)研究的便利工具。

致謝 感謝湛江市紅樹林保護(hù)區(qū)林廣旋工程師和我校海洋資源與環(huán)境監(jiān)測中心張瑜斌老師等在樣本采集方面給予的無私幫助, 謹(jǐn)致謝忱。王中鐸, 郭昱嵩, 陳榮玲等, 2009. 南海常見硬骨魚類COⅠ條碼序列. 海洋與湖沼, 40(5): 608—614

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