閆文鳳 楊志明

綜 述

氧化應激與心肌細胞缺血再灌注損傷

閆文鳳 楊志明

氧化應激； 冠狀動脈粥樣硬化性心臟??； 心肌缺血再灌注

1957年，美國克里夫蘭臨床中心首先將大隱靜脈搭橋術應用于冠心病患者，此后冠狀動脈粥樣硬化性心臟病血運重建治療快速發(fā)展。冠狀動脈溶栓術、經(jīng)皮冠狀動脈成形術、冠狀動脈支架植入術、冠狀動脈旁路手術已成為挽救缺血心肌的重要治療方式。經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）能夠快速開通閉塞血管，恢復冠脈血流，在臨床取得顯著療效，并由于其血管開通率高、出血等并發(fā)癥少等優(yōu)點得到廣泛應用。但血流恢復本身也會引起顯著的損傷，部分患者在血供恢復后，出現(xiàn)細胞超微結構變化、細胞代謝障礙、細胞內(nèi)外環(huán)境改變，導致缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion-associated tissue injury，IRI），臨床表現(xiàn)為心律失常、心力衰竭等。IRI也出現(xiàn)在心臟手術、心臟移植、心肺復蘇等臨床情況后。目前研究表明，細胞IRI的機制主要包括氧自由基含量增多、細胞內(nèi)鈣超載、線粒體膜去極化等。氧化還原失衡是IRI發(fā)生的重要起始因素，但其機制和細胞中存在的保護機制尚不完全明確。本文重點對氧化應激與心肌IRI的研究進展作一綜述。

1 氧化應激和心肌細胞損傷

氧化應激（oxidative stress，OS）主要是由于內(nèi)源性和（或）外源性刺激引起機體代謝異常而驟然產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS）。ROS是指在外層電子軌道含有一個或多個不配對電子的原子、原子團或分子，包括超氧陰離子（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、過氧亞硝酸鹽（ONOO-）和羥基自由基（·OH）。ROS作為第二信使介導了許多生理性及病理性細胞事件，包括細胞分化、過度生長、增殖及凋亡。超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶作為體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，在維持體內(nèi)氧化還原平衡方面發(fā)揮重要的作用。但在IRI過程中，參與合成ROS的酶體系增多，且活性更強，如NADPH氧化酶、線粒體黃素酶、黃嘌呤氧化酶、未耦聯(lián)的一氧化氮合酶、細胞色素P450、脂氧合酶、環(huán)氧合酶和過氧化物酶體，ROS的生成量明顯高于細胞內(nèi)的清除能力，導致氧化還原失衡。ROS雖然半衰期很短，但其氧化活性極強，能夠與細胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生過氧化反應，造成細胞結構損傷和代謝障礙。

ROS與細胞膜的氧化反應主要是細胞膜磷脂分子中不飽和脂肪酸的過氧化，生成脂質(zhì)過氧化物，再經(jīng)過氧化物酶分解生成丙二醛（MDA），最終磷脂結構發(fā)生變化，生物膜受到嚴重損傷，細胞膜和細胞器膜的液態(tài)性、流動性降低，通透性升高，造成細胞腫脹，細胞內(nèi)肌紅蛋白和肌鈣蛋白等大分子蛋白外滲；溶酶體膜的不穩(wěn)定引起溶酶外泄，激活細胞自噬通路；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜受損引起Ca2+釋放進入胞質(zhì)導致細胞內(nèi)鈣超載，同時誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其相關的凋亡通路。蛋白質(zhì)的過氧化反應引起酶蛋白的失活，線粒體內(nèi)膜上與能量代謝有關的酶如細胞色素C還原酶、檸檬酸合酶等活性下降將導致線粒體能量代謝障礙；細胞膜受體、離子通道和肌漿網(wǎng)鈣泵蛋白的過氧化引起細胞信號通路傳導功能障礙和正常生理調(diào)節(jié)功能受損。ROS對核酸的直接攻擊造成DNA斷裂和染色體畸變。

2 心肌細胞中ROS的主要來源

NADPH氧化酶是細胞內(nèi)ROS的最主要來源，是由催化亞基gp91phox或其同系物，即非吞噬細胞氧化酶 1～4（NOX1～4）、雙功能氧化酶 1～2（Duox1～2）、跨膜亞基p22phox、胞漿亞基p47phox、p67phox等蛋白分子共同組成的多亞基蛋白復合體。NOX家族蛋白亞型與跨膜亞基、胞漿亞基結合并組裝成有活性的復合體后發(fā)揮其生物學功能。活化的NADPH氧化酶復合物與NADPH結合并釋放2個電子，通過黃素腺嘌呤二核苷（FAD）傳遞給亞鐵血紅素，與細胞膜外側(cè)的2個氧分子結合生成O2-，最后生成H2O2、過氧化硝酸鹽（ONOO-）、羥基團（-OH）及其他基團[1,2]。NOX源性的ROS在維持機體穩(wěn)態(tài)中是把雙刃劍，NOX源性ROS一方面在氧化還原信號通路中起第二信使作用，參與多種細胞生理功能；另一方面在高血壓、動脈粥樣硬化及心肌IRI的病程中發(fā)揮重要作用，因此單一抑制NOX活性對治療心肌IRI并不是最好的選擇。Braunersreuther等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，在30 min缺血到24 h再灌注小鼠模型中，NOX4基因敲除組與NOX1和NOX2敲除組相比，心肌梗死面積更大，提示內(nèi)源性NOX4在IRI中可能發(fā)揮著心肌細胞保護作用。

黃嘌呤氧化酶（XO）是IRI中ROS產(chǎn)生的另一重要來源，與合成抗氧化劑尿酸的黃嘌呤還原酶（XDH）作用相反。XDH/XO活力受細胞因子、細胞內(nèi)化學物質(zhì)及激素的調(diào)節(jié)。細胞缺血時XO活力升高，并且ATP分解產(chǎn)物次黃嘌呤積聚，再灌注時O2大量介入，次黃嘌呤和氧在XO作用下反應生成O2-·和H2O2。有研究指出，XO不僅通過合成ROS參與心肌缺血再灌注損傷，XO本身亦可以與白細胞產(chǎn)生相互作用，造成微循環(huán)阻塞，導致再灌注的無復流現(xiàn)象。此外，XO可以直接損傷血管內(nèi)皮細胞（EC）或通過ROS間接損害EC，影響心肌血流再灌注[4]。

3 心肌細胞膜結構參與氧化應激

已經(jīng)認識到IRI可以引起細胞膜磷脂的損傷，膜結構流動性和穩(wěn)定性受損。膜穩(wěn)定劑應用組與對照組相比，乳酸脫氫酶（LDH）、特異性肌鈣蛋白（cTnI）的釋放明顯減少，細胞內(nèi)Ca2+超載減弱，細胞凋亡介導因子caspase-3活性完全受抑[5]。但細胞膜的損傷也是IRI的重要機制，細胞氧化應激損傷參與其中，在缺氧-復氧造成的IRI模型中應用膜穩(wěn)定劑和應用抗氧化劑可以起到相似的細胞保護作用[5]。脂筏（LR）是鞘脂和膽固醇在生物膜上構成的一種微區(qū)結構。質(zhì)膜微囊（Caveolae）是脂筏的一種。它們參與信號轉(zhuǎn)導和物質(zhì)運輸，激素、生長因子等胞外調(diào)節(jié)分子信號通過Caveolae傳入胞內(nèi)，在信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮樞紐作用。Caveolae與內(nèi)皮型細胞一氧化氮合酶（eNOS）、NADPH氧化酶等共同形成信號平臺。Caveolae的標志蛋白陷窩蛋白-1（Caveolin-1）通過與 NOXs、p22連接，將 NADPH氧化酶定位在小窩上，這些與細胞氧化應激反應相關的功能性復合物形成氧化還原信號平臺。富集Caveolin-1的質(zhì)膜微囊影響NADPH氧化酶的組裝、移位和ROS介導的信號轉(zhuǎn)導[6,7]。Caveolin-1 siRNA敲除Caveolin-1可以抑制脂筏所介導的NADPH氧化還原信號激活[8]。缺少膜膽固醇的平滑肌細胞模型中，外界不良刺激誘導的ROS的合成和細胞增殖水平降低[9]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，Caveolae不僅參與細胞的IRI過程，同時也起著保護作用[10]。在心肌、腦、后肢缺血性損傷模型中，Caveolin-1基因敲除小鼠與野生型相比，損傷程度更嚴重[11]。質(zhì)膜微囊的組成除Caveolin-1外，還有Caveolin-2、Caveolin-3等。Caveolin-2具有增強質(zhì)膜微囊內(nèi)部結構的作用，但并不影響微囊中其他成分的表達。而在相同條件下，Caveolin-3敲除的小鼠與對照組相比，IRI顯著并出現(xiàn)線粒體腫脹，七氟醚、替普瑞酮等可通過此途徑發(fā)揮對心肌的保護作用[12,13]。

4 心肌細胞線粒體參與氧化應激

ATP生成減少、Ca2+過荷、ROS大量產(chǎn)生及線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（membrane permeability transition pore，mPTP）持續(xù)開放等是線粒體參與心肌細胞IRI的主要機制。各機制之間相互關聯(lián)、相互影響，共同介導了心肌IRI過程中的線粒體功能障礙，最終導致細胞凋亡、組織損傷。線粒體是ROS介導細胞氧化損傷的主要靶點，同時也是ROS產(chǎn)生的重要位點。再灌注損傷是造成線粒體ROS生成的重要原因之一，其中線粒體電子傳遞鏈是ROS生成的主要來源。生理狀態(tài)下，由復合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及電子載體組成的線粒體電子傳遞鏈利用分子氧進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，但在心肌IRI過程中，其完整性遭到破壞，復合物Ⅰ、Ⅲ成為ROS電子來源，其中復合體Ⅲ的Q循環(huán)中Q0位點中半醌自由基（UQH·）是O2-·的單電子來源，還原細胞色素C（Cyt-C）是生成H2O2的雙電子供體。線粒體呼吸鏈產(chǎn)生的O2-·和H2O2構成生物體內(nèi)最大數(shù)量ROS的恒定來源。過量產(chǎn)生的ROS損害線粒體的膜系統(tǒng)，影響線粒體膜兩側(cè)的質(zhì)子梯度，引起膜結構蛋白質(zhì)和脂質(zhì)過氧化，膜通透性增加，電子傳遞鏈活性進一步下降，形成惡性循環(huán)，最終造成線粒體破裂[14,15]。線粒體電子傳遞鏈上ROS生成的具體位點尚不完全明確，但呼吸鏈電子傳遞受阻仍然是呼吸鏈大量生成O2-·和H2O2等ROS的必要條件。

生理情況下線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）具有間斷性開放的功能，維持線粒體基質(zhì)與外室之間的物質(zhì)平衡。但在持續(xù)氧化應激、ROS過量蓄積、Ca2+超載的情況下，mPTP不可逆性持續(xù)開放。MPTP的開放一方面引起線粒體內(nèi)外離子平衡失調(diào)，線粒體膜電位（ΔΨm）迅速下降，線粒體腫脹，ATP耗竭，甚至細胞死亡。另一方面，mPTP的開放會導致Cyt-C釋放進入胞漿，啟動caspase級聯(lián)凋亡反應，最終引起細胞凋亡。但Abdallah等的研究提示，在I/R中，線粒體內(nèi)Ca2+超載是mPTP不可逆開放的原因，ROS過量生成是mPTP開放后的一種結果?？傊琺PTP開放、線粒體功能障礙、氧化應激相互影響，構成心肌細胞IRI的重要機制[16,17]。

線粒體DNA（mtDNA）缺乏結合蛋白的保護和完善的損傷修復系統(tǒng)，直接暴露于氧化磷酸化過程中產(chǎn)生的高反應性氧中，氧化損傷是mtDNA突變的主要原因。心肌I/R中，ROS過量生成，致使核酸分子發(fā)生過氧化反應且無法修復，相應結構蛋白組分表達缺失，又將引起呼吸鏈中斷，膜電位崩潰，ATP合成受阻，ROS生成增多，形成惡性循壞直至線粒體崩解，細胞凋亡、壞死。Yue等[18]的研究證明，番茄紅素可保護IRI誘導的心肌細胞mtDNA氧化損傷。

5 心肌細胞核參與氧化應激

細胞核膜也是細胞膜結構的一種，將真核細胞的細胞核和細胞質(zhì)隔離開來。附著在細胞核膜上的核三磷酸核苷酶（NTPase）為核質(zhì)物質(zhì)交換提供能量，脂質(zhì)過氧化反應抑制NTPase活性，mRNA和蛋白多肽的轉(zhuǎn)運受到影響[19]。

心肌細胞中的肌球蛋白除參與心肌細胞收縮以外，位于細胞核中的肌球蛋白還可以作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈（MLC20）能夠與NOX2基因啟動子上游靶序列結合，調(diào)控NOX2的表達[20]。腦組織IRI模型中，肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈激酶（MLCK）上調(diào)MLC20的磷酸化水平，增加NOX2和NOX4的表達，促進IRI中的氧化應激反應。MLCK的特異性抑制劑ML-7抑制上述反應的發(fā)生，與NOX抑制劑DPI具有相似的細胞保護效應[21]。

細胞核對于氧化應激反應具有一定的保護能力，如沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）。Sirt1是Sirtuins家族成員之一，具有相當高的NAD+依賴性組蛋白脫乙酰化酶的活性。Sirt1主要位于細胞核中，在氧化應激中Sirt1表達上調(diào)，作用于FoxO家族成員，保護心肌細胞免于氧化應激損傷。此外，Sirt1可以通過去乙酰化作用抑制P53的活性而保護細胞免受凋亡，對PGC-1α的去乙?；饔锰岣唧w內(nèi)抗氧化酶的水平，對于細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持起到重要的作用[22,23]。

6 心肌細胞中的幾種信號通路與氧化應激

氧化應激造成心肌細胞IRI的機制一直是研究的熱點，目前已探明的細胞內(nèi)信號通路包括以下幾個：Zhang等[24]在缺氧-復氧誘導的H9c2細胞模型中發(fā)現(xiàn)，ROS清除劑依達拉奉降低JNK活性和Egr-1的表達水平，JNK抑制劑 SP600125抑制Egr-1的表達，并且對Egr-1蛋白表達水平的抑制作用呈劑量依賴性。實驗證實，在細胞IRI中存在ROS/JNK/Egr-1通路，并指出N-正丁基氟哌啶醇通過抑制此通路保護細胞。Li等[25]在相同細胞模型中，以SP600125和SB203580（P38抑制劑）分別作用于細胞，檢測JNK、p38MAPK表達，證實兩者之間存在級聯(lián)關系，并能影響凋亡相關蛋白BCL-2、Bax及caspase-3的表達，槲皮素通過抑制此通路保護IRI中的細胞。Ma等[26]用氧氣-葡萄糖剝奪（OGD） 的方法誘導 IRI模型，ROS、JNK、NF-κB 的表達均上調(diào)，應用SP600125后細胞凋亡和NF-κB信號傳導途徑均受到抑制，人參提取物人參皂苷Rb3能通過抑制ROS/JNK/NF-κB通路在細胞IRI中起保護作用。

在了解心肌IRI機制的基礎上，研究人員致力于阻斷損害通路、明確細胞自身保護通路的研究，為缺血性心臟病的治療提供基礎研究支持。Li等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，在IRI的組織中除氧化應激反應增強，Bcl-2、caspase-3和 caspase-9的表達上調(diào)，還出現(xiàn)PI3K、Akt和GSK-3β的表達受抑現(xiàn)象。已證明H2S對心血管系統(tǒng)具有保護作用，但LY294002（PI3K特異性阻滯劑）能夠阻斷H2S對心肌IRI的保護作用。研究結果表明，H2S通過上調(diào)PI3K/Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達保護心肌。Zhang等[28]對兩組小鼠心臟組織進行缺血再灌注處理，其中一組為Notch3 siRNA處理組。與對照組比較發(fā)現(xiàn)，Notch3通過激活Akt通路防止心肌IRI，抑制心肌細胞凋亡，抑瘤素M（OSM）通過OSM受體（Oβ）誘導的細胞保護作用激活這一通路而起作用。

總之，細胞中的膜結構、細胞器、細胞核在心肌IRI中均有參與。目前研究已明確多種藥物能夠通過抑制細胞內(nèi)氧化應激反應防治IRI。但氧化應激信號在細胞生長、增殖等正常生理活動中具有重要的信號傳導作用，對氧化應激反應的完全抑制不利于心肌組織的正常工作。因此我們進一步明確損傷性ROS合成途徑、作用通路及細胞內(nèi)存在的保護機制，有利于選擇性抑制IRI中的氧化應激，為其臨床應用提供理論基礎和研究方向。

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Oxidative stress and myocardial ischemia-reperfusion injury

Oxidative stress； Coronary heart disease； Myocardial ischemia-reperfusion injury

國家自然科學基金（項目編號：81570273）

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院心血管內(nèi)科

楊志明，E-mail：zhimingyang800@sina.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．09．001

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A

1672-5301（2016）09-0769-04

2016-03-28）