王源，潘旭東

缺血性卒中是卒中最常見的形式，按照急性卒中治療低分子肝素試驗病因分型法（The Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分為大動脈粥樣硬化型卒中（large artery atherosclerotic，LAA），小動脈閉塞型卒中（small artery occlusion，SAO），心源性栓塞（cardioembolism，CE），其他原因的急性卒中（stroke of other determined etiology，SOE）和原因未明的卒中（stroke of undetermined etiology，SUE）[1]。卒中的發(fā)病原因復(fù)雜，亞型的重要價值在于區(qū)分不同發(fā)病原因，提出不同的治療方案，提高治療效果和預(yù)后。目前較為公認的LAA型卒中主要由動脈粥樣硬化繼發(fā)動脈閉塞或狹窄導(dǎo)致的，SAO型卒中主要由小動脈的玻璃樣變、脂質(zhì)變性和小動脈硬化導(dǎo)致，CE型卒中由心源性栓子導(dǎo)致。

近年不斷有新的分型提出，針對TOAST分型的不足做改進，但病因亞型的核心沒有改變，并且這些新的分型仍有不足。在現(xiàn)階段，TOAST病因分型仍為最重要的分型。

缺血性卒中的診斷主要依靠顱腦計算機斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振做出。要做好亞型分類首先需要腦血管的顯像檢查，包括磁共振血管造影（magnetic resonance angiography，MRA）、CT血管造影（CT angiography，CTA）、數(shù)字減影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）、顱腦超聲，還需要做心臟超聲等。但在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，即使腦血管顯像檢查和心臟檢查完善，仍有部分患者無法做出準確亞型分類，比如大動脈粥樣硬化和小動脈閉塞并存，確定此次發(fā)病的亞型困難，對治療方案制訂造成影響；合并存在心房顫動和大動脈狹窄應(yīng)被列入病因未明亞型，對治療和預(yù)后判斷也造成困難。此外，由于兩種亞型的病因并存情況較多，造成病因未明亞型比例過高，對治療和預(yù)后造成不利影響，需要新的技術(shù)手段對亞型給予區(qū)分。近年來，有些技術(shù)正在引起關(guān)注，其中卒中相關(guān)血漿標志物的檢測日益增多，為反映不同亞型的病因和發(fā)病機制、探討患者的預(yù)后，從而進一步指導(dǎo)臨床治療及二級預(yù)防提供了新的依據(jù)，下面將該領(lǐng)域的進展做一綜述。

1 LAA型卒中的相關(guān)血漿標志物

LAA型卒中是缺血性卒中最常見的類型，約占全部腦梗死的60%，是在各種原因的基礎(chǔ)上，腦動脈主干或分支動脈管腔狹窄超過50%、閉塞，引起腦局部血流減少或中斷，使腦組織缺血、缺氧性壞死，出現(xiàn)局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征[1]。目前認為動脈粥樣硬化為此型腦梗死的基本原因，與動脈粥樣硬化相關(guān)的血漿標志物有以下幾種。

1.1 微小核糖核酸 微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類由21～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，主要通過與靶mRNA 3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）不完全互補配對的方式在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控靶mRNA表達，最終導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[2]。

已有研究證實，miRNAs能以穩(wěn)定的形式存在于人體血漿中[3]。既往研究顯示，miRNAs在血管內(nèi)皮細胞炎癥和衰老，血管平滑肌細胞增生，血管完整性維持及膽固醇代謝等過程中發(fā)揮調(diào)控作用，并且在神經(jīng)元損傷及缺血性卒中發(fā)病過程中也起到重要調(diào)控作用[4-8]。

Hergenreider等[9]研究顯示，miR-143在正常動脈的平滑肌細胞中高表達，在血管受損后表達下調(diào)，對患有動脈粥樣硬化的小鼠注射miR-143微泡，能減少小鼠體內(nèi)動脈粥樣硬化病變的形成。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）能夠介導(dǎo)內(nèi)皮細胞的凋亡進而參與血管慢性炎癥反應(yīng)，靶基因預(yù)測結(jié)果顯示TNF-α是miRNA-23a的靶基因之一，Ruan等[10]研究表明miR-23a通過caspase-7的絲氨酸/蘇氨酸激酶4-caspase-3的途徑調(diào)節(jié)TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡。動脈粥樣硬化是動脈壁對血管內(nèi)皮細胞損傷的一種慢性炎癥過程，血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）介導(dǎo)內(nèi)皮細胞損傷后的黏附過程，生物學(xué)功能分析顯示VCAM-1是miR-126的潛在靶點之一。因此miRNA-126可能通過調(diào)節(jié)VCAM-1的表達參與血管炎癥的形成，Long等[11]的研究表明，miRNA-126可作為缺血性卒中潛在的標志物。

本課題組采用高通量測序技術(shù)對人類血漿miRNAs表達譜也進行了研究，研究結(jié)果表明，LAA型卒中患者及SAO型卒中患者血漿miRNAs表達譜存在明顯差異，提示miRNAs可能通過靶基因在LAA及SAO的發(fā)病過程中發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用[12-13]。此外本課題組對存在差異表達的部分miRNAs進行了實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗證及生物信息學(xué)分析，研究表明，血漿中miRNA-146b和miRNA-23a水平在LAA型腦梗死組顯著降低且與病情的嚴重程度呈負相關(guān)，提示二者可作為LAA型腦梗死的急性期血漿標志物，并有助于判斷病情的嚴重程度[14]；miR-143、miR-126與腦動脈粥樣硬化的廣泛程度相關(guān)，且受腦梗死影響較小，可考慮作為腦動脈粥樣硬化的血漿標志物[15]。

目前，miRNA與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的相關(guān)研究尚處于初期階段，兩者的關(guān)系有待于進一步闡明，這可能會成為新的研究領(lǐng)域，為LAA型卒中的診療帶來益處。

1.2 骨保護素 骨保護素（osteoprotegerin，OPG）是1997年Tsuda等在人胚胎肺纖維細胞中發(fā)現(xiàn)的一種分泌蛋白，是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族的一員，具有調(diào)節(jié)骨密度的作用。在隨后的更多研究中，OPG與心血管疾病的關(guān)系越來越被重視，它可保護血管內(nèi)皮細胞、抑制血管鈣化和動脈粥樣硬化，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

到目前為止，已有許多關(guān)于OPG和動脈粥樣硬化的研究，OPG對動脈粥樣硬化介導(dǎo)作用的機制正在慢慢被揭開。Golledge等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，細胞間黏附分子隨著OPG與腫瘤壞死因子的濃度增加而增加，單核細胞結(jié)合在這些黏附分子上，隨著它們進入血管內(nèi)膜，這是動脈發(fā)生粥樣硬化的關(guān)鍵步驟之一。斑塊內(nèi)炎性細胞及其炎性產(chǎn)物可能是造成斑塊不穩(wěn)定、斑塊破裂的促發(fā)因素。巨噬細胞是構(gòu)成不穩(wěn)定斑塊的主要細胞。不穩(wěn)定斑塊處OPG水平升高，T淋巴細胞表達核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）增多，單核細胞分泌RANK增多。Sandberg等[17]對100例胸痛患者進行血漿OPG分析，發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定型心絞痛患者及正常對照組相比，不穩(wěn)定型心絞痛患者的血清OPG水平明顯升高。該研究同時發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過冠狀動脈介入治療（這是一種醫(yī)源性斑塊破裂）的患者，外周血單核細胞可表達更多的RANKL。RANKL可促使單核巨噬細胞聚集與浸潤，并由此使粥樣斑塊中平滑肌骨化，可增加不穩(wěn)定型心絞痛患者基質(zhì)金屬蛋白酶在血管平滑肌中的活性，使細胞浸潤、粥樣斑塊生長。OPG可通過競爭RANK與RANKL結(jié)合，從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶在血管平滑肌中的活性。同時OPG和RANKL結(jié)合可抑制血清RANKL的清除，穩(wěn)定RANKL水平。這個研究還發(fā)現(xiàn)了蛋白酶似乎在動脈粥樣硬化斑塊基質(zhì)降解中起了關(guān)鍵作用，使其容易破裂。

本課題組采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）測定血漿OPG、sRANKL水平，比較三組間血漿OPG、sRANKL水平；同時為評價LAA組患者腦動脈粥樣硬化廣泛程度，將LAA組分為單支、雙支、多支病變3個亞組，評價OPG、sRANKL、OPG/sRANKL比值與AS廣泛程度的相關(guān)性。對LAA組患者隨訪3個月，結(jié)合mRS評分，應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估OPG、sRANKL、OPG/sRANKL比值對預(yù)后的預(yù)測價值。研究結(jié)果表明血漿OPG、sRANKL水平與LAA型卒中的發(fā)病、AS病變廣泛程度及預(yù)后有關(guān)；可作為評價LAA型卒中的發(fā)病及AS病變廣泛程度的血漿標志物；尤其是OPG/sRANKL比值有助于評估AS廣泛程度和判斷預(yù)后[18]。

1.3 S-100B蛋白 S-100蛋白是一種酸性鈣結(jié)合蛋白，相對分子質(zhì)量21 000 Da，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位的星狀神經(jīng)膠質(zhì)細胞的細胞液中，因其在飽和硫酸銨中能夠100%溶解而得名。S-100蛋白由α和β兩種亞基組成3種不同的形式，即S-100αα、S-100ββ、S-100αβ，其中S-100ββ、S-100αβ統(tǒng)稱為S-100B蛋白。S-100B蛋白主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細胞和神經(jīng)膜細胞中。星形膠質(zhì)細胞作為大腦中最豐富的膠質(zhì)細胞，其末梢參與組成完整的血腦屏障，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞損傷時，缺血區(qū)星形膠質(zhì)細胞通過凋亡和壞死兩種方式死亡，S-100B蛋白從細胞液中釋放，并且血腦屏障的破壞在早期再灌注時，可使原來存在于局部缺血梗死核心區(qū)的大量S-100B蛋白釋放入血液，因此，外周血中S-100B蛋白作為一種特異性腦源性蛋白，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的特異和敏感的生物標志物。較早的研究均發(fā)現(xiàn)，急性缺血性卒中（acute cerebral ischemic stroke，AIS）時S-100B蛋白水平顯著增高，對AIS的診斷和預(yù)后有重要意義[19]。近期的研究結(jié)果也顯示，S-100B蛋白參與的生物標志物組合，早期診斷AIS顯示出較高的敏感度和特異性[20]。但Dassan等[21]也指出，雖然S-100B蛋白主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，但因黑色素瘤、肌上皮細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等也可表達S-100B蛋白，在缺血性卒中時不能排除神經(jīng)系統(tǒng)以外的因素使S-100B蛋白升高的可能性，其得出的結(jié)論是：應(yīng)用S-100B蛋白早期診斷缺血性卒中特異性低，在卒中急性期S-100B蛋白并沒有迅速出現(xiàn)明顯升高，在癥狀出現(xiàn)24 h后開始升高，峰值出現(xiàn)在第3天。臨床上尚無健康人群的外周血或腦脊液S-100B蛋白正常值的統(tǒng)一標準，這也造成了各項試驗中對S-100B蛋白的評估標準不統(tǒng)一。對于S-100B蛋白的應(yīng)用價值，有待進一步深入研究。

1.4 妊娠相關(guān)血漿蛋白A 妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy associated plasma protein A，PAPP-A）是一種鋅離子結(jié)合的金屬蛋白酶，由不穩(wěn)定性斑塊中的各種活化細胞產(chǎn)生并釋放到細胞外基質(zhì)中。PAPP-A在腐蝕和破裂的冠狀動脈及頸動脈斑塊纖維帽肩部的單核-巨噬細胞中大量表達，而在穩(wěn)定性斑塊中極少表達。PAPP-A還是一種特異的胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor-1，IGF-1）激動劑，使活化的IGF-1結(jié)合到細胞表面1型IGF受體，IGF-1能誘導(dǎo)細胞增殖、分化和遷移，激活炎癥細胞，促進斑塊的發(fā)展和去穩(wěn)定性。Sangiorgi等[22]提出PAPP-A是頸動脈斑塊去穩(wěn)定性和破裂的一個標志物，并且有可能成為腦血管事件危險分層的一個新靶點。既往研究中，穩(wěn)定性斑塊組與不穩(wěn)定性斑塊組、穩(wěn)定性斑塊組與不穩(wěn)定性破裂斑塊組之間、不穩(wěn)定性斑塊未破裂組與不穩(wěn)定性破裂斑塊組之間血清PAPP-A水平差異均具有顯著性，而穩(wěn)定性斑塊組與不穩(wěn)定性斑塊未破裂組之間差異無顯著性，血清PAPP-A水平與斑塊易損程度呈正相關(guān)關(guān)系[23]。表明PAPP-A可能與頸動脈斑塊的去穩(wěn)定和破裂相關(guān)，特別是與破裂關(guān)系可能更加密切。

1.5 基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組Zn2+、Ca2+依賴性蛋白酶，其主要功能是降解和重構(gòu)細胞外基質(zhì)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)20多種MMPs家族成員，按其分子結(jié)構(gòu)及底物的不同可分為明膠酶（MMP-2、MMP-9），膠原酶（MMP-1、MMP-8），基質(zhì)溶解酶（MMP-3、MMP-7、MMP-10），膜型基質(zhì)蛋白酶和其他不能分類的基質(zhì)酶5類。正常狀態(tài)下，MMPs被控制在較低水平，但在一些病理條件下，其活性顯著增加，參與組織的損傷與修復(fù)。在缺血的早期，內(nèi)皮細胞屏障即受損，導(dǎo)致水分子和其他小分子物質(zhì)滲出，此時，基膜層的屏障作用也被破壞，而MMPs系統(tǒng)是參與細胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)的重要因子，尤其是MMP-9含有纖維蛋白結(jié)合區(qū)域，可以特異性攻擊層蛋白、纖連蛋白等，與細胞外基質(zhì)的降解關(guān)系最為密切。既往國內(nèi)外的許多臨床研究也證實，AIS患者血清MMP-9水平在超早期即出現(xiàn)顯著升高，因此可應(yīng)用于早期輔助診斷AIS[24]。Ramos等[25]對22項相關(guān)研究、3289例AIS患者進行回顧性研究分析，指出與對照組相比，MMP-9在缺血性卒中急性期即出現(xiàn)顯著升高，并與梗死范圍、梗死嚴重程度及預(yù)后損傷程度顯著相關(guān)。各項相關(guān)研究結(jié)果均提示，MMP-9作為輔助診斷AIS的生物標志物具有很大的臨床應(yīng)用潛力。

1.6 可溶性CD40配基 CD40和CD40L（CDl54）均為腫瘤壞死因子超家族成員，由參與AS形成的主要細胞共同產(chǎn)生，兩者之間的相互作用增加了各種促AS因子的表達，如各種黏附分子、化學(xué)因子、細胞因子、生長因子和MMP。Zirlik等[26]用低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受體缺陷小鼠證實，CD40是粥樣斑塊發(fā)展的重要信號，阻斷CD40能抑制AS病變的進展；當(dāng)斑塊破裂誘導(dǎo)血小板活化時，則會導(dǎo)致斑塊表面CD40L表達增加，從而介導(dǎo)血管壁內(nèi)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，激活內(nèi)皮細胞，促進血液凝固，最終導(dǎo)致急性腦缺血事件的發(fā)生和發(fā)展。Hocher等[27]的研究表明，與對照組相比，急性缺血性卒中患者血小板表面sCD40和單核細胞表面CD40表達顯著增加，說明兩者可能參與了易損斑塊的形成和血栓形成事件的發(fā)生。

2 SAO型卒中的相關(guān)血漿標志物

SAO型卒中是指大腦半球或腦干深部的小穿通動脈，在長期高血壓的基礎(chǔ)上，血管壁發(fā)生病變，導(dǎo)致管腔閉塞，形成小的梗死灶。目前認為病因主要與高血壓引起的腦部小動脈玻璃樣變、動脈硬化性病變及纖維素樣壞死等有關(guān)。

2.1 miRNA SAO型卒中發(fā)病的病因主要與高血壓引起的腦部小動脈玻璃樣變、動脈硬化性病變及纖維素樣壞死等有關(guān)。近年來，已有研究表明高血壓發(fā)病的機制受到miRNAs目的基因的調(diào)控，眾所周知，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)在血壓升高過程中起到重要作用。已有研究表明血管緊張素Ⅱ 1型受體（angiotensinⅡ type 1 receptor，AT1R）和miR-155在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞共同表達，miR-155可在翻譯水平抑制AT1R表達[28]。另外，用轉(zhuǎn)化生長因子-β1處理原代培養(yǎng)的人肺成纖維細胞能使miR-155表達下調(diào)，而TNF-α僅和干擾素-β可誘導(dǎo)巨噬細胞表達miR-155，造成炎癥過程中性粒細胞/單核細胞增多。因此，miR-155可能是炎性介質(zhì)的靶點和調(diào)節(jié)淋巴細胞和骨髓細胞功能的靶點。業(yè)已證實，缺血性腦損傷后，腦組織和血液中miR-155表達水平均顯著下調(diào)[29]。

本課題組通過高通量測序在LAA型及SAO型腦梗死的差異表達的miRNAs進行了進一步熒光定量PCR驗證及生物學(xué)功能分析，結(jié)果表明，miRNA-451a在SAO型患者血漿中表達顯著下調(diào)，miR-320a、miR-99b、miR-127在SAO型患者血漿中表達顯著上調(diào)，提示miRNA-451a、miR-320a、miR-99b、miR-127可作為SAO型腦梗死的急性期血漿標志物[14]。

2.2 α2巨球蛋白 α2巨球蛋白（α2-macroglobulin，α2-MG）是一種蛋白酶抑制物，通過中和血纖維蛋白溶解酶、纖溶酶原激活物和金屬蛋白酶促進凝血。此外，α2-MG被認為是白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的載體蛋白而參與炎癥反應(yīng)。已有研究表明α2-MG在急性卒中患者的血漿中含量高于正常人，并且差異具有顯著性，提示α2-MG可能作為急性腦血管疾病的生物標志物[30]。此外，該研究認為α2-MG水平與腦白質(zhì)病變有關(guān)，可能反映出慢性腦小血管疾病的病理生理過程。

本課題組應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法對LAA型卒中、SAO型卒中及健康對照患者血漿α2-MG濃度進行了測定。研究結(jié)果表明α2-MG水平可考慮作為診斷SAO的血漿標志物，是SAO的獨立危險因素，且與腦部白質(zhì)損害程度密切相關(guān)[31]。

2.3 細胞間黏附分子-1 細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）又叫作CD54，屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族中的成員，是介導(dǎo)黏附反應(yīng)重要的一個黏附分子。ICAM-1在靜息的血管內(nèi)皮細胞上呈低水平表達，通過與血管內(nèi)皮細胞表面上的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)活性。作為白細胞和內(nèi)皮細胞跨膜的蛋白質(zhì)，ICAM1在穩(wěn)定細胞間相互作用和促進白細胞和內(nèi)皮細胞的遷移起到重要作用。ICAM-1的受體有淋巴細胞功能相關(guān)抗原-1（lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1）和Mac-1，均屬于整合素家族。LFA-1是ICAM-1的主要受體，而Mac-1與ICAM-1的親和力較低，纖維蛋白原也可成為ICAM-1的配體之一。ICAM-1（G1548A）基因多態(tài)性研究表明ICAM-1表達增加為急性卒中的一個獨立的危險因素[32]。

3 CE型卒中的相關(guān)血漿標志物

心源性腦栓塞占腦栓塞發(fā)病的60%～75%，是由于心內(nèi)膜或心瓣膜產(chǎn)生的栓子脫落到達腦血管，造成動脈堵塞致病。其中，心房顫動為心源性栓塞最常見的原因，心房顫動時左房收縮性降低，血流緩慢淤滯，易導(dǎo)致附壁血栓，栓子脫落形成腦栓塞。

3.1 可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體 晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）屬于細胞表面分子免疫球蛋白超家族中的一個成員，可與多種配體結(jié)合后影響細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、刺激細胞因子釋放等從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，與動脈粥樣硬化及炎癥等密切相關(guān)。胞外區(qū)的RAGE稱可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體（soluble receptor for advanced glycation endproducts，sRAGE），可阻斷配體與RAGE結(jié)合，抑制RAGE的作用。

Montaner等[33]的研究顯示，與動脈粥樣硬化血栓形成及腔隙性梗死相比，心源性腦栓塞患者的sRAGE水平較高，提示sRAGE水平可為腦梗死亞型的判斷提供診斷依據(jù)。Park等[34]的研究顯示，非心源性卒中患者sRAGE水平較低，認為低sRAGE水平是動脈粥樣硬化過程的潛在生物學(xué)標志物。

本課題組采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測CE患者37例，LAA患者36例，以及無癥狀大動脈狹窄患者43例，健康對照組48例血漿中sRAGE的濃度，并比較各組sRAGE水平的差異，研究結(jié)果表明sRAGE濃度增高是CE的獨立危險因素；log sRAGE=3.5197 pg/ml可作為鑒別CE與LAA的最佳臨界值；且sRAGE水平增高可考慮用于判斷CE的復(fù)發(fā)（待發(fā)表）。

3.2 D二聚體與腦鈉肽 已有研究對707例缺血性卒中患者進行血液生物標志物檢測，結(jié)果顯示腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）及D二聚體（D-Dimer）等在心源性栓塞卒中亞型患者中高表達且對CE預(yù)測如下：當(dāng)BNP＞76 pg/ml及D-dimer＞0.96 μg/ml時，OR值（odds ratios）分別為2.3與2.2[35]。

綜上所述，血漿標志物可以幫助臨床醫(yī)生對缺血性腦血管病進行準確的病因分型，為進一步指導(dǎo)治療及二級預(yù)防提供了新的依據(jù)。要找到缺血性卒中不同亞型的血漿標志物，需具備特異性強、敏感度高且利于TOAST亞型區(qū)分等特點。但目前上述標志物仍需進一步研究與驗證。

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