韓旭+楊衍+孫繼華+劉昭華+牛玉+曹振木

摘 要 鑒定黃燈籠辣椒根系分泌物的化學(xué)成分，為研究其化感作用及連作障礙的機(jī)理提供理論依據(jù)。采用砂培法收集黃燈籠辣椒的根系分泌物，柱層析法分離根系分泌物，依次選用石油醚、乙酸乙酯、氯仿和甲醇洗脫根系分泌物并收集各洗脫組分，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）鑒定各組分的化學(xué)成分。研究結(jié)果表明，黃燈籠辣椒根系分泌物石油醚組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)57個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共28個(gè)；乙酸乙酯組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)73個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共28個(gè)；氯仿組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)67個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共27個(gè)；甲醇組分GC-MS鑒定圖譜共出現(xiàn)55個(gè)物質(zhì)峰，相似度大于85%的化學(xué)物質(zhì)共28個(gè)。黃燈籠辣椒根系分泌物中含有烷烴類、脂類、酸類、醇類、酚類、醛類、肟類、吡咯烷酮類、酰胺類和萘胺類化合物。

關(guān)鍵詞 黃燈籠辣椒 ；根系分泌物 ；化學(xué)成分 ；鑒定 ；砂培法

分類號(hào) S641.3

Identification of Chemical Components of Root Exudates

of Sand-cultured Capsicum chinense Jacquin

HAN Xu1） YANG Yan1） SUN Jihua2） LIU Zhaohua1） NIU Yu1） CAO Zhenmu1）

（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737；

2 Institute of Scientific and Technical Information， CATAS， Haikou， Hainan 571737）

Abstract The chemical component of Capsicum chinense Jacquin root exudates were identified in this study in order to provide scientific basis for investigation of allelopathy and the mechanism of cropping obstacles. The root exudates of Capsicum chinense Jacquin were collected by sand culture. The extracts were fractionated by petroleum ether， ethyl acetate， chloroform and methanol respectively， through the column chromatography for root exudates isolation. And the chemical component of root exudates were identified by Gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The results are as follows： there were 57 peaks of chemical component in the GC-MS chromatograms of petroleum ether extraction from Capsicum chinense Jacquin root exudates， and there were 28 chemical component of SI more than 85%； there were 73 peaks of chemical component in the GC？MS chromatograms of ethyl acetate extraction， and there were 28 chemical component of SI more than 85%； there were 67 peaks of chemical component in the GC？MS chromatograms of chloroform extraction， and there were 27 chemical component of SI more than 85%； there were 55 peaks of chemical component in the GC-MS chromatograms of methanol extraction， and there were 28 chemical component of SI more than 85%. The root exudates of Capsicum chinense Jacquin are composed of alkane， lipids， acids， alcohols， phenols， aldehydes， oxime， pyrrolidone， amide， amine and naphthalene compounds.

Keywords Capsicum chinense Jacquin ； root exudates ； chemical component ； identification ； sand culture

根系分泌物是復(fù)雜的非均一的體系，通常指在特定的環(huán)境下，活體植物根系的不同部位釋放到根際環(huán)境中有機(jī)化合物的總稱[1]。根系分泌物所含的有機(jī)化合物一般在200種以上，分為3類，一類是大分子化合物，主要包括糖、蛋白質(zhì)、酶和凝膠等；一類是小分子化合物，主要包括酸、酚、酮等；一類是生長激素、黃酮、甾類等[2]。植物根系分泌物在土壤結(jié)構(gòu)組成、養(yǎng)分活化、植物養(yǎng)分吸收和緩解環(huán)境脅迫等方面具有重要作用[3-5]，所以對根系分泌物的研究越來越引起重視。砂培法是收集植物根系分泌物的常規(guī)方法，通常選用石英砂為栽培基質(zhì)，石英砂的惰性較強(qiáng)，因此不會(huì)影響植物的正常生長，并且具有一定的機(jī)械阻力，使得植物根系的生長更接近土壤培養(yǎng)，并消除了土壤微生物的干擾[6]。氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀是鑒定植物根系分泌物化學(xué)成分的常用方法，具有需樣量小、靈敏度高、健全數(shù)據(jù)庫比對等特點(diǎn)。因此，采用砂培法和氣質(zhì)聯(lián)用法分離鑒定植物根系分泌物的化學(xué)成分是切實(shí)可行的，對于解決連作障礙問題具有重要意義。

黃燈籠辣椒（Capsicum chinense Jacquin），又稱黃帝椒、黃辣椒，是茄科茄亞族辣椒屬植物，是1983年國際植物遺傳資源委員會(huì)（IBPGR）確定的5個(gè)辣椒栽培種之一，是海南省特有的辣椒品種。其成熟果實(shí)形狀似燈籠，色澤呈金黃色，肉質(zhì)較厚，味極辣，有特殊香味，營養(yǎng)豐富，富含辣椒素、Vc、胡蘿卜素和多種礦物質(zhì)[7]，在飲食和醫(yī)藥產(chǎn)品上廣泛應(yīng)用，是加工辣椒醬和提取辣椒素最好的原料，是海南省最具開發(fā)潛力的特色農(nóng)產(chǎn)品之一[8-10]。但栽培管理制度的不合理及生產(chǎn)環(huán)境的局限性等因素導(dǎo)致黃燈籠辣椒連作障礙日益加劇，嚴(yán)重影響辣椒生長發(fā)育、果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量形成，根系分泌物的逐年累積是導(dǎo)致連作障礙的重要因素。因此，本研究通過砂培法收集黃燈籠辣椒的根系分泌物，采用硅膠柱層析法分離和GC-MS鑒定根系分泌物的化學(xué)成分，為黃燈籠辣椒根系分泌物的深入研究提供理論基礎(chǔ)，這對減緩黃燈籠辣椒的連作障礙具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

熱辣2號(hào)黃燈籠辣椒，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所瓜菜研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 黃燈籠辣椒根系分泌物的收集

采用砂培法收集黃燈籠辣椒的根系分泌物：將石英砂高溫高壓滅菌，70℃烘干備用。將催芽后的熱辣2號(hào)種子播于含有石英砂的培養(yǎng)箱中，每7 d澆一次營養(yǎng)液，其余時(shí)間補(bǔ)足蒸餾水，按正常苗期管理。生長40 d后向培養(yǎng)箱中注入過量蒸餾水，拔掉辣椒苗，拭干并稱根重，浸泡石英砂后通過雙層定性濾紙過濾，并通過0.45 μm的水系微孔濾膜抽濾，即得到根系分泌物的粗提物，減壓濃縮到 30.0 g/L即得到黃燈籠辣椒根系分泌物粗提物原液。

1.2.2 黃燈籠辣椒根系分泌物化學(xué)成分的分離

將50 mL黃燈籠辣椒根系分泌物粗提物原液與5 g 硅膠（BDH 200～300 目）混勻，40℃水浴蒸干，作為提取物。用石油醚（60～90℃）和 100 g 硅膠（BDH 200～300 目）填充色譜柱（200 mm×30 mm），靜止過夜。將提取物置于色譜柱頂端，根據(jù)有機(jī)溶劑極性從小到大的順序，分別用 500 mL 石油醚，乙酸乙酯、氯仿和甲醇逐級洗脫，流速控制在1 滴/1～2 秒。分別收集各洗脫液，40℃減壓濃縮至干，并溶于 10 mL 甲醇（色譜純），-20℃冰箱保存，進(jìn)一步鑒定化學(xué)成分。

1.2.3 黃燈籠辣椒根系分泌物化學(xué)成分的鑒定

采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（ThermoFisher GC-MS，Trace GC ultra-DSQ-AI3000， USA）鑒定黃燈籠辣椒根系分泌物的化學(xué)成分。GC-MS分析條件：

色譜條件：毛細(xì)管柱 DB5-MS （30 m × 0.25 mm， 膜厚度 0.25 μm）；載氣 He（流速1.0 mL/min）；進(jìn)樣口溫度 250℃；程序升溫：柱溫 50℃（保持 2 min），以 6℃/min 程序升溫至 250℃（保持15 min）。

質(zhì)譜條件：離子源溫度 200℃；EI 源（電子轟擊源）；轟擊電壓 70 eV；掃描范圍 m/z 30～600 amu；1 μL 進(jìn)樣，不分流。

化學(xué)成分的篩選：根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩選的結(jié)果，選擇相似度≥85的化合物為黃燈籠辣椒根系分泌物的有效化學(xué)成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃燈籠辣椒根系分泌物石油醚組分GC-MS鑒定結(jié)果

熱辣2號(hào)根系分泌物的石油醚組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖1所示。共出現(xiàn)57個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.051 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為48.345 min，主要出峰時(shí)間集中在28～42 min，最高峰出現(xiàn)在10.088 min。

熱辣2號(hào)根系分泌物石油醚組分中相似度大于85%的化合物共有28個(gè)，其中烷烴類化合物10個(gè)，脂類化合物11個(gè)，醇類化合物3個(gè)，酚類化合物1個(gè)，醛類化合物1個(gè)，肟類化合物1個(gè)，吡咯烷酮類化合物1個(gè)。見表1。

2.2 黃燈籠辣椒根系分泌物乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結(jié)果

熱辣2號(hào)根系分泌物的乙酸乙酯組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖2所示。共出現(xiàn)73個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.051 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為47.571 min，主要出峰時(shí)間集中在27～42 min，最大峰面積出現(xiàn)在40.384 min。

熱辣2號(hào)根系分泌物乙酸乙酯組分中相似度大于85%的化合物共有28個(gè)，其中烷烴類化合物10個(gè)，脂類化合物10個(gè)，肟類化合物1個(gè)，吡咯烷酮類化合物1個(gè)，酚類化合物1個(gè)，醇類化合物4個(gè)，酰胺類化合物1個(gè)。見表2。

2.3 黃燈籠辣椒根系分泌物氯仿組分GC-MS鑒定結(jié)果

熱辣2號(hào)根系分泌物的氯仿組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖3。共出現(xiàn)67個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.053 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為48.349 min，主要出峰時(shí)間集中在20～26 min及29～42 min，最大峰面積出現(xiàn)在40.376 min。

熱辣2號(hào)根系分泌物氯仿組分相似度大于85%的化合物共有27個(gè)（表3），其中脂類化合物16個(gè)，醛類化合物1個(gè)，酚類化合物1個(gè)，烷烴類化合物5個(gè)，醇類化合物2個(gè)，萘胺類化合物2個(gè)。

2.4 黃燈籠辣椒根系分泌物甲醇組分GC-MS鑒定結(jié)果

熱辣2號(hào)根系分泌物甲醇組分GC-MS鑒定結(jié)果如圖4所示。共出現(xiàn)55個(gè)物質(zhì)峰，第一個(gè)出峰時(shí)間為6.055 min，最后一個(gè)出峰時(shí)間為47.578 min，主要出峰時(shí)間集中在30～40 min，最大峰面積出現(xiàn)在30.282 min。

熱辣2號(hào)根系分泌物甲醇組分相似度大于85%的化合物共有28個(gè)，其中有機(jī)酸類化合物2個(gè)，脂類化合物14個(gè)，肟類化合物1個(gè)，吡咯烷酮類化合物1個(gè)，酚類化合物1個(gè)，烷烴類化合物4個(gè)，醇類化合物3個(gè)，酰胺類化合物2個(gè)。見表4。

3 討論與結(jié)論

對辣椒根系分泌物的收集通常采用水培的方法[11-12]，該方法雖然操作簡單，在一定程度上反映某些特定根系分泌物的變化，并排除了土壤微生物的干擾，但水培植物根毛發(fā)育較少，沒有土壤的機(jī)械阻力，與植物在土壤中生長分泌的物質(zhì)略有不同。因此，本研究采用滅菌的石英砂為栽培基質(zhì)，對黃燈籠辣椒的根系分泌物進(jìn)行收集，既保證了辣椒的正常生長，又很好的消除了其他植物或土壤微生物對根系生長的干擾。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，黃燈籠辣椒根系分泌物中主要含有烷烴類、脂類、酸類、醇類、酚類、醛類、肟類、吡咯烷酮類、酰胺類和萘胺類化合物。前人研究結(jié)果表明，大豆根系分泌物中含有烷烴類、醇類、酸類、酚類、醛類、脂類化合物[13-14]；油菜根系分泌物中主要含有烷烴類、醇類、脂類、酸類物質(zhì)[15]；大白菜根系分泌物中主要含有烷烴類、酸類、脂類物質(zhì)[16]；低效刺槐根系分泌物中主要含有酸類、脂類、醇類物質(zhì)[17]；人參根系分泌物中主要含有烷烴類、脂類、酸類物質(zhì)[18]；丹參根系分泌物中主要含有烷烴類、醇類、酸類、脂類、醛類物質(zhì)[19]。本研究結(jié)果與其基本一致，不同作物根系分泌物含有不同類的化學(xué)成分。

已有研究表明，植物釋放到環(huán)境中的化感物質(zhì)可分為14大類，包括有機(jī)酸、脂肪族醛和酮、直鏈醇、長鏈脂肪酸和多炔、簡單不飽和內(nèi)酯、苯甲酸及其衍生物、萘醌、蒽醌和復(fù)合醌、肉桂酸及其衍生物、簡單酚、香豆素類、類萜和甾類化合物、類黃酮、單寧、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、氨基酸和多肽、嘌呤和核苷[20-23]。本研究中黃燈籠辣椒根系分泌物中也可能含有化感物質(zhì)，逐年累積產(chǎn)生化感自毒作用，導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生，但哪些化學(xué)成分是化感物質(zhì)，起到化感自毒作用，還有待進(jìn)一步研究。GC-MS鑒定植物根系分泌物的化學(xué)成分不夠全面和充分，有待進(jìn)一步選用其他的方法（如LC-MS）鑒定黃燈籠辣椒根系分泌物的有效化學(xué)成分。

參考文獻(xiàn)

[1] 吳林坤，林向民，林文雄. 根系分泌物介導(dǎo)下植物-土壤-微生物互作關(guān)系研究進(jìn)展與展望[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，38（3）：298-310.

[2] 陳龍池，廖利平，汪思龍，等. 根系分泌物生態(tài)學(xué)研究[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2002，21（6）：57-62.

[3] Guo T， Zhang G， Zhou M， et al. Influence of Aluminum and Cadumium Stresses om Mineral Nutrition and Root Exudates in Two Barley Cultivars[J]. Pedosphere， 2007， 17 （4）： 505-512.

[4] Xie M J， Yan C L， Ye J. Effect of phenanthrene on the secretion of low molecule weight organic compounds by rye grass root[J]. Ecology and Environment， 2008， 17 （2）： 576-579.

[5] Zeng F， Chen S， Miao Y， et al. Changes of organic acid exudation and rhizosphere pH in rice plants under chromium stress[J]. Environmental Pollution， 2008， 155 （2）： 284-289.

[6] 李 汛，段增強(qiáng). 植物根系分泌物的研究方法[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，32 （4）：540-547.

[7] 高芳華，伍壯生，鄧長智. 海南黃燈籠辣椒高產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 辣椒雜志，2009（2）：18-20.

[8] 吉訓(xùn)聰，王健華，王運(yùn)勤，等. 海南黃燈籠辣椒種傳病毒的初步鑒定[J]. 海南大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，12（3）：284-288.

[9] 高建華，李惠安，寧正祥. 海南黃燈籠椒發(fā)酵剁椒的護(hù)色研究[J]. 食品科技，2010，35（5）：63-66.

[10] 李洪福，李海龍，王 勇，等. 海南黃燈籠辣椒不同提取物化學(xué)成分GC-MS分析[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19 （8）：129-133.

[11] 謝振華，趙尊練，武國平，等. 線辣椒不同生育階段根系分泌物的組分分析[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（8）：175-181，206.

[12] 張婷玉，林 多，楊延杰. 辣椒根系分泌物的收集方法研究[J]. 北方園藝，2014（12）：14-17.

[13] 馬鳳鳴，王安娜，吳 蕾，等. 大豆根系分泌物的鑒定及PAL1PAL2，C4H的克隆[J]. 作物雜志，2011（02）：65-71.

[14] 吳 泉. 分析大豆根系分泌物并檢測其化感作用[J]. 河南科技，2013 （10）：213-221.

[15] 張 紅，高亞軍，安 蓉. 油菜根系分泌物的GC-MS檢測方法研究[J]. 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，31（3）：290-295.

[16] 張照然，范黎明，吳毅歆，等. 大白菜根系分泌物的GC-MS分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，25（9）：75-77.

[17] 石 鑫，魏天興，陳 玨，等. 低效刺槐林根系分泌物的GC-MS分析[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（15）：135-137.

[18] 張愛華，彭洪利，雷鋒杰，等. 人參根系分泌物的提取與鑒定[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42（7）：1-6.

[19] 楊先國，劉塔斯，陳 斌，等. 丹參根際土壤浸提物的GC-MS分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（10）：173-177.

[20] Kong C H， Wang P， Xu X H. Allelopathic interference of Ambrosia trifida with wheat（Triticumaestivum）. Agr Ecosyst Environ， 2007， 119（3/4）： 416-420.

[21] Wang P， Liang W J， Kong C H. Allelopathic potentials of volatile allelochemicals of Ambrosia trifida L. on other plants. Allelopathy J， 2005， 15 （1）： 131-136.

[22] Tamura Y， Hattori M， Konno K， et al. Triterpenoid and caffeic acid derivatives in the leaves of ragweed， Ambrosia artemisiifolia L. （Asterales： Asteraceae）， as feeding stimulants of Ophraella communa LeSage （Coleoptera： Chrysomelidae）. Chemoecology， 2004， 14 （2）： 113-118.

[23] Blmu U. Allelopathic interactions involving phenolic acids. J Nematol， 1996， 28： 259-267.