陳倩倩+劉波+劉國(guó)紅+車建美+龔海艷

摘 要 為了解華重樓根際芽胞桿菌種群多樣性信息，本研究采用稀釋平板法分離福建省光澤縣華重樓品種根際的芽胞桿菌，并對(duì)其進(jìn)行16S rRNA序列分析。結(jié)果表明：從華重樓根際共分離到17個(gè)形態(tài)差異的芽胞桿菌菌株；16S rRNA序列分析表明，17個(gè)菌株鑒定為8個(gè)種，歸屬于4個(gè)屬，芽胞桿菌屬（Bacillus）、賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinibacillus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）和綠芽胞桿菌屬（Viridibacillus），其中芽胞桿菌屬的種類和數(shù)量最多。經(jīng)抑菌試驗(yàn)分析，芽孢桿菌屬的特基拉芽孢桿菌FJAT-43012對(duì)尖孢鐮刀菌具有抑制作用。本研究結(jié)果表明，華重樓根際芽胞桿菌種群多樣性較為豐富。本研究對(duì)芽胞桿菌資源的開發(fā)和利用提供良好的實(shí)驗(yàn)材料和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 芽胞桿菌 ；華重樓 ；根際土壤 ；多樣性

分類號(hào) Q938.1

Diversity of Culturable Bacillus Species from Paris Linnaeus

Rhizosphere Soil

CHEN Qianqian LIU Bo LIU Guohong CHE Jianmei GONG Haiyang

（1 Agrobiological Resource Research Institute，

Fujian Academy of Agriculture Sciences， Fuzhou， Fujian 350003

2 Ministry of Education Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract The aim of this study was to determine the diversity of the cultivable Bacillus species population in the rhizosphere of Paris Linnaeus. Bacillus species were isolated from the soil samples from Guangze， Fujian Province by using dilution plating technique on Nutrient-Agar medium. 17 isolates were obtained through morphological difference， andidentified by 16S rRNA. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequencing showed that the 17 isolates were grouped into 4 genera （Bacillus， Lysinibacillus， Paenibacillus and Viridibacillus） with 9 distinct species. All of these species were owned to the genus Bacillus. B.tequilensis FJAT-43012 possessed significantly inhibitory activities against Fusarium oxysporum. In conclusion， the result of this study showed that the population diversity of the cultivable bacteria was abundant andvarious. The findings providean important scientific base for the development and utilization of Bacillus resources.

Keywords Bacillus ； Paris Linnaeus ； rhizosphere soil ；diversity

華重樓（Paris Linnaeus）屬百合科多年生草本植物，又名燈臺(tái)七、七葉一枝花等，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，此外還有止血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及保護(hù)心血管等多方面的生理活性，是一些重要中成藥和新藥如云南白藥、宮血寧等主要成分之一[1-2]，開發(fā)和利用這一自然資源有十分重要的意義。我國(guó)為該屬植物的分布中心之一，共有19種，種類多，廣泛分布于福建、云南、四川、江蘇、安徽、浙江、江西等省區(qū)[3]，福建是華重樓的主要分布區(qū)。華重樓根莖多年生，莖葉當(dāng)年倒苗，繁殖率低，從發(fā)芽到藥用，一般需5年以上，種子存在二次休眠，資源再生慢[4]。藥用植物多與微生物共生，根際微生物通過(guò)產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物影響植物生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、固氮或植物激素的產(chǎn)生[5-7]。植物根際是土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的環(huán)境，土壤細(xì)菌既是土壤微生物區(qū)系的重要組成部分，也是土壤物質(zhì)流和能量流的主要推動(dòng)者[8]。

芽孢桿菌是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢(shì)微生物種群，其特征是能夠產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)的芽孢，這對(duì)菌體的生存、產(chǎn)品加工及其在環(huán)境中的存活和定殖都十分有利，是一種理想的生防菌，許多性狀優(yōu)良的拮抗菌株已成功地應(yīng)用于植物病害的生物防治中[9]。分離、篩選各種不同的芽胞桿菌為生物農(nóng)藥的開發(fā)等提供了基礎(chǔ)資源[10]，具有重要意義。土壤是芽胞桿菌主要的來(lái)源，對(duì)華重樓根系土芽胞桿菌的研究，可揭示微生物種群構(gòu)成，推動(dòng)促生菌的發(fā)掘，有效解決資源保護(hù)和開發(fā)利用的矛盾問(wèn)題。本次試驗(yàn)從采集自福建省南平市光澤縣的華重樓根系土中分離芽胞桿菌，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分類，探究該土壤是否含有促進(jìn)華重樓生長(zhǎng)的特殊功能芽孢桿菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土樣

本次試驗(yàn)所用土樣為蘇海蘭于2015年4月采集。采集地點(diǎn)為福建省南平市光澤縣用刮刀輕輕刮取附著在華重樓根表面的土壤，視為根際土壤。土壤樣品采集后放入無(wú)菌袋內(nèi)，置于4℃冰箱備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏0.3%，酵母浸膏0.1%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，瓊脂1.7%，pH 7.0～7.2。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 0.5%，瓊脂 1.7%，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵液體培養(yǎng)基：葡萄糖 0.5%，牛肉膏 0.3%，蛋白胨 1%，MgSO4·7H2O 0.02%，pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化

將采自于福建省南平市光澤縣華重樓根系土，進(jìn)行系列10倍梯度稀釋后，置到80℃的水浴中加熱10 min，然后涂布于LB培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3～5 d后，挑取平板上的單菌落進(jìn)行連續(xù)劃線純化保存菌株。

16S rRNA擴(kuò)增：DNA提取按照DNA提取試劑盒（generay bitehch）操作。以芽胞桿菌基因組為模板，16S rRNA擴(kuò)增采用細(xì)菌通用16S rRNA引物[11]27F （5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），由上海博尚生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)試劑：10×Buffer， dNTP（10 mM/each），Taq酶（2.5 U/μL，上海博尚生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），100 bp Marker（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。擴(kuò)增條件為 94℃，預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物的檢測(cè)：取各模板的全部 PCR產(chǎn)物，加入相應(yīng)量的6×Loading Buffer，點(diǎn)樣于1.0%的瓊脂糖凝膠中，以100 bp plus Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量，100 V電壓，電泳40 min，核酸染料染色。

測(cè)序由上海博尚公司完成，序列同源性比對(duì)在EzTaxon[12]（http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net/）進(jìn)行。

1.2.2 芽胞桿菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)對(duì)分離得到的芽胞桿菌16S rRNA基因序列鑒定的結(jié)果，利用ClustalX 1.81軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析[13]，采用軟件Mega 6.0對(duì)芽胞桿菌的16S rRNA基因序列構(gòu)建聚類[14-15]。使用鄰接法 （Neighbor Joining）進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的建立。

1.2.3 FJAT-43012對(duì)尖孢鐮刀菌FJAT-30512的抑制實(shí)驗(yàn)

將FJAT-43012和FJAT-30512在30℃、170 r/min下分別培養(yǎng)2和3 d。吸取尖孢鐮刀菌FJAT-30512菌懸液1.0 mL，加入到熔化并冷卻到50℃的100 mL 0.9%PDA培養(yǎng)基中，混勻后作為上層培養(yǎng)基，傾覆在已凝固的PDA培養(yǎng)基上。待上層培養(yǎng)基凝固后，待平板冷卻后在平板中間打直徑6 mm孔，注入FJAT-43012發(fā)酵液上清100 μL，以加無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，30℃培養(yǎng)2 d，測(cè)抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 華重樓根際土壤中芽胞桿菌的分離鑒定

從福建省南平市光澤縣華重樓的根際土中分離到17株芽胞桿菌，菌落形態(tài)見圖1。根據(jù)菌落形態(tài)特征，包括菌落顏色、表面干濕度、是否光滑、是否有光澤、邊緣是否整齊等，對(duì)17株分離芽胞桿菌進(jìn)行分析，可分為10大類。其中FJAT-42999、FJAT-43004、FJAT-43006：菌落濕潤(rùn)，呈白色，表面光滑、圓形扁平、邊緣波形、不透明；FJAT-43002、FJAT-43003、FJAT-43010：菌落淡黃色，圓形扁平、濕潤(rùn)、邊緣整齊、不透明；FJAT-43001：菌落點(diǎn)狀，呈淡黃色，光滑而粘稠、圓形凸起、邊緣整齊、透明；FJAT-43004：菌落濕潤(rùn)，呈黃色，濕潤(rùn)、圓形隆起、邊緣整齊、不透明；FJAT-43000和FJAT-43009：菌落呈黃色，粗糙、扁平、邊緣波形、不透明；FJAT-43005、FJAT-43007和FJAT-43008：菌落粗糙，呈淡黃色，有褶皺、邊緣波形、不透明；FJAT-43011：菌落呈黃色，粗糙、根狀、扁平、不透明；FJAT-43012：菌落干燥，呈黃色，有褶皺、圓形扁平、邊緣整齊、透明；FJAT-43013：菌落濕潤(rùn)，呈黃色，粗糙、圓形扁平、邊緣整齊、不透明；FJAT-43014和FJAT-43015：菌落干燥，有褶皺、圓形扁平、邊緣裂片、不透明。

利用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 500 bp處有特異性條帶。測(cè)序結(jié)果與Ez-Taxon數(shù)據(jù)庫(kù)中16S rRNA序列比對(duì)分析。17株芽胞桿菌與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道菌株具有較高的相似性（≥98%），17株芽胞桿菌鑒定為4屬9個(gè)種，分別為芽胞桿菌屬（Bacillus）的簡(jiǎn)單芽胞桿菌（B. simplex）、食丁酸芽胞桿菌（B. butanolivorans）、惠州芽胞桿菌（B. huizhouensis）、炭疽芽胞桿菌（B. anthracis）、特基拉芽胞桿菌（B. tequilensis）和圖瓦永芽胞桿菌（B. toyonensis）；賴氨酸芽胞桿菌屬（Lysinibacillus）的解木糖賴氨酸芽胞桿菌（L. xylanilyticus）；類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）的土地類芽胞桿菌（P. terrigena）；綠芽胞桿菌屬（Viridibacillus）的內(nèi)德綠芽胞桿菌（V. arenosi），均屬于芽胞桿菌科（Bacillaceae）。

2.2 華重樓根際芽胞桿菌數(shù)量分析

通過(guò)表1數(shù)據(jù)可以得出，在華重樓的根基土壤中，芽胞桿菌屬的含量為3.7×105 cfu/g，綠芽胞桿菌屬含量為4×104 cfu/g，賴氨酸芽胞桿菌屬的含量為3×105 cfu/g，類芽胞桿菌屬的含量為5×104 cfu/g。芽孢桿菌屬的含量最高，種類也最豐富，其次為賴氨酸芽孢桿菌屬。

2.3 華重樓根際芽胞桿菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），可見所鑒定的9種芽胞桿菌主要分布于5個(gè)分支上，為此可將其可歸結(jié)為5小類：B.simplex、B. butanolivorans或B. butanolivorans：FJAT-42999、FJAT-43000、FJAT-43003；B. toyonensis或B. anthracis：FJAT-43005、FJAT-43007；B. tequilensis：FJAT-43012；Paenibacillus terrigena：FJAT-43001；Viridibacillus arenosi或Lysinibacillus xylanilyticus：FJAT-43002、FJAT-43010。

2.4 特基拉芽孢桿菌FJAT-43012生防功能分析

FJAT-43012的發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌FJAT-30512具有明顯的抑菌活性，培養(yǎng)2 d后的抑菌圈直徑為1.8 cm，說(shuō)明FJAT-43012發(fā)酵培養(yǎng)所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)尖孢鐮刀菌具有很好的生物防治作用（圖3）。

3 討論

自然界中的植物與微生物共生，而根際是微生物與植物相互作用的微環(huán)境。微生物利用植物根系分泌的代謝產(chǎn)物及脫落物中的物質(zhì)，如糖類、氨基酸和酶等為營(yíng)養(yǎng)微生物自身生長(zhǎng)和繁殖[16]。在這種營(yíng)養(yǎng)較為豐富的環(huán)境中，微生物的數(shù)量和群落遠(yuǎn)高于散土，其中細(xì)菌對(duì)根際物質(zhì)的利用率和敏感性高于放線菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物等，從而在根際中最為活躍并占主導(dǎo)地位，并能在植物根系定殖和共生。據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)描述，芽胞桿菌屬是一類產(chǎn)生芽胞的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，菌體呈桿狀，能夠形成內(nèi)生芽胞，營(yíng)好氧或兼性厭氧生活。Pisa等[17]發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌和假單胞菌（Pseudomonas）是典型的土壤微生物，它們能夠利用植物根系的分泌物和脫落物進(jìn)行快速生長(zhǎng)繁殖，可以從植物根際中分離獲得。

在華重樓根際土中分離得到4屬9個(gè)種的芽胞桿菌，其中的優(yōu)勢(shì)種群為解木糖賴氨酸芽胞桿菌和特基拉芽胞桿菌，菌落含量分別為3×105和2×105 cfu/g。Lee等[18]由森林的腐殖土中分離出解木糖賴氨酸芽胞桿菌，這種芽胞桿菌能夠降解木聚糖。木聚糖是植物細(xì)胞中半纖維素的主要成分，占植物細(xì)胞干重的35%，是一種豐富的生物質(zhì)資源，是自然界中除纖維素之外含量最豐富的多糖[19]，可替代石油作為新能源。野生華重樓多生于山地林下或路旁草從的陰濕處，土壤中植物枯枝敗葉多，與上文Lee等的分離環(huán)境類似，因而能夠分離到解木糖賴氨酸芽胞桿菌。自然界中很大一部分木聚糖未被有效利用，造成很大的資源浪費(fèi)，此種芽胞桿菌具有轉(zhuǎn)化這種難降解吸收資源的應(yīng)用前景。特基拉芽胞桿菌具抑制細(xì)菌，如大腸桿菌生物膜形成的作用[20]，華重樓根際土分離的特基拉芽胞桿菌FJAT-43012發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌FJAT-30512具有明顯的抑菌活性，可能幫助華重樓抵御真菌病害。此外，綠芽胞桿菌屬含量為4×104 cfu/g，這種芽胞桿菌首次于2005年在荷蘭農(nóng)業(yè)研究基地Drentse A分離[21]，目前對(duì)這類芽胞桿菌的研究較少，功能還未明確。在華重樓的根際土壤中，共分離到四個(gè)屬的可培養(yǎng)的芽胞桿菌，種類豐富。其中的解木糖賴氨酸芽胞桿菌FJAT-43010可作為新能源的開發(fā)利用的潛力菌株；特基拉芽胞桿菌FJAT-43012可作為農(nóng)業(yè)上的生防菌。本研究對(duì)芽胞桿菌資源的開發(fā)和利用提供良好的實(shí)驗(yàn)材料和理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 湯海峰，趙越平，蔣永培. 重樓屬植物的研究概況[J]. 中草藥，1998，29（12）：839-842.

[2] 袁理春，陳 翠，楊麗云，等. 滇重樓根狀莖繁殖誘導(dǎo)初報(bào)[J]. 中藥材，2004，27（7）：477.

[3] 李 恒. 重樓屬植物[M]. 北京： 科學(xué)出版社，1998.

[4] 李運(yùn)昌. 滇重樓的無(wú)性繁殖[J]. 云南植物研究，1986，8（2）：209-212.

[5] 李 祎，楊彩云，鄭天凌. 自然環(huán)境中細(xì)菌的生存方式及其群落特征[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2013，19 （4）：553-560.

[6] Brown M E. Seed and root bacterization[J]. Annual Reviewof Phytopathology， 1974， 12： 311-331.

[7] Swaby R L. Stimulation of plant growth byorganic matter[J]. Journal of the Australian Institute of Agricultural Science， 1942， 8： 156-163.

[8] 張 英，朱 穎，姚 拓，等. 分離自牧草根際四株促生菌株互作效應(yīng)研究[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2003，22（1）：29-37.

[9] 任士偉，邢小霞，董向麗. 生防芽孢桿菌的分離篩選與初步鑒定[J]. 現(xiàn)代農(nóng)藥，2011，10（1）：44-47.

[10] 胡嬋娟，劉國(guó)華，吳雅瓊. 土壤微生物生物量及多樣性測(cè)定方法評(píng)述[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（6/7）：1 161-1 167.

[11] 王志穎，劉 鵬，徐 艷. 2013. 抑制劑對(duì)鋁脅迫下油菜根系代謝有機(jī)酸和相關(guān)酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013， 33（5）： 1 430-1 440.

[12] RE·布坎南，NE·吉本斯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)：第8版[M]. 北京：科學(xué)出版社，1984：729-760.

[13] Thompson J D， Gibson T J， Plewniak F， et al. The CLUSTAL_X windows interface： Flexible strategies formultiple sequence alignment aided by quality analysistools[J]. NucleicAcids Research， 1997， 25： 4 876-4 882.

[14] Saitou N， Nei M. The neighbor-joining method： A newmethod for reconstructing phylogenetic trees[J]. MolecularBiology and Evolution， 1987（4）： 406-425.

[15] Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al. MEGA6： Molecularevolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2013，30： 2 725-2 729.

[16] Pisa G， Magnani G S， Weber H， et al. Diversity of 16S rRNA genes from bacteria of sugarcane rhizosphere soil[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research， 2011，44： 1 215-1 221.

[17] Lee C S， Jung Y T， Park S， et al. 2010. Lysinibacillus xylanilyticus sp. nov.， a xylan-degrading bacterium isolated from forest humus[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology Feb， 2010， 60（Pt 2）： 281-286.

[18] Gregory A C E， Connell A， Bolw ell P G. Xylans[J]. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews， 1998， 15（4）： 439-455.

[19] Kim O S， Cho Y J， Lee K， et al. Introducing EzTaxon-e： A prokaryotic 16S rRNA gene sequence database withphylotypes that represent uncultured species[J]. InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology， 2012， 62： 716-721.

[20] Arun K P， Nilotpala P G M. Application of Lipopeptide Biosurfactant Isolatedfrom a Halophile： Bacillus tequilensis CH for Inhibitionof Biofilm[J]. Appl Biochem Biotechnol， 2013， 171： 1 362-1 375.

[21] Heyrman J， Rodríguez-Díaz M， Devos J， et al. Bacillusarenosi sp. nov.， Bacillus arvi sp. nov. and Bacillus humi sp. nov.， isolated from soil[J]. International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology， 2005， 55： 111-117.