堿性蛋白酶制備高水解度羊骨膠原肽的工藝研究

甄守艷1，霍乃蕊2，王凱1，程稚玲1，王鈺慧1，姚薇1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

摘要：為改善骨膠原的營(yíng)養(yǎng)和生理功能，優(yōu)化羊骨粉的堿性蛋白酶水解工藝，制備高水解度的膠原多肽，以鄰苯二甲醛法測(cè)定水解度，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法，建立了水解度與料水比(X1)、溫度(X2)、時(shí)間(X3)、加酶量(X4)的二次多項(xiàng)回歸數(shù)學(xué)模型，方差分析結(jié)果表明此模型擬合度高。對(duì)模型最優(yōu)解適當(dāng)調(diào)整，X1、X2、X3、X4分別為9%(W/V)、45 ℃、325 min和4.25%(E/S)，pH9條件下酶解，測(cè)得水解度為28.12%，接近預(yù)測(cè)值28.39%，進(jìn)一步說(shuō)明所建模型可靠，可對(duì)不同條件下的水解度進(jìn)行預(yù)測(cè)，為羊骨的高值化、安全化利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：羊骨粉；膠原多肽；堿性蛋白酶；鄰苯二甲醛法

收稿日期：2015-07-10修回日期：2015-09-11

作者簡(jiǎn)介：甄守艷(1988-)，女(漢)，山西五臺(tái)人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)

通訊作者：*霍乃蕊，教授，碩士生導(dǎo)師。Tel：0354-6289236；E-mail：tgnrhuo@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31201347)；山西省回國(guó)留學(xué)人員項(xiàng)目(2014-042)

中圖分類號(hào)：TS202.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Preparation of Sheep Ossein Peptide with High Degree of Hydrolysis by Alcalase

Zhen Shouyan1, Huo Nairui2, Wang Kai1, Cheng Zhiling1, Wang Yuhui1, Yao Wei1

(1．CollegeofFoodScienceandEngineering,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China; 2．CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China)

Abstract:To improve the nutritional and physiological function of bone collagen, parameters were optimized to prepare ossein peptides with high degree of hydrolysis(DH) by hydrolyzing sheep bone powder with the protease of alcalase. DH was determined by o-phthalaldehyde(OPA) methodology. In light of the results of single-factor experiments, response surface analysis was carried out and a mathematical model was established to describe the DH in response to the levels of bone powder concentration(X1), temperature(X2),time(X3), and the amount of added alcalase.Variance analysis suggested that the model showed high fitting degree. Sheep bone powder was hydrolyzed at pH 9 and under the adjusted optimized parameters of the model, X1、X2、X3、X4 was 9%(W/V)、45 ℃、325 min and 4.25%(E/S)respectively, the determined DH was 28.12%, which was close to the predicted 28.39%.This further confirmed the reliability of the established model which can be used to predict the DH when sheep bone powder was hydrolyzed by alcalase. The results of this study will also provide a theoretical guidance for the high-value and safe utilization of sheep bone.

Key words:Sheep bone powder； Collagen polypeptide； Alcalase； O-phthalaldehyde methodology

我國(guó)羊骨資源豐富，但加工利用能力不足，深加工技術(shù)落后，附加值很低，造成資源的巨大浪費(fèi)，實(shí)現(xiàn)羊骨的高值利用具有潛在的市場(chǎng)價(jià)值。羊骨營(yíng)養(yǎng)豐富，膠原蛋白占總蛋白的90%以上，但膠原蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以被吸收利用，并且骨中的鈣磷等礦物元素主要以羥基磷灰石形式存在，由骨膠原粘合固定，也不易被有效利用，因此骨粉中的蛋白質(zhì)和Ca、P的生物利用度很低。酶解是利用畜骨資源的一條有效途徑，不僅可制備高附加值的膠原多肽，并且在水解過(guò)程中使Ca、P等礦物元素釋放。腸道對(duì)多肽的吸收能力高于游離氨基酸，利用率高達(dá)100%[1～3]，并且羊骨膠原多肽還具有促免疫、抗氧化、美容、抑菌、防治骨質(zhì)疏松、降血壓等生理作用[4～7]；水解過(guò)程中形成的離子鈣也更容易被人體吸收，部分還可與膠原肽形成生物利用度更高的肽鈣螯合物。水解度不同，蛋白肽的主要功能不同，多肽產(chǎn)品的腥苦味也與水解度有關(guān)[8]，因此在制備具有某個(gè)特定功能的蛋白多肽產(chǎn)品時(shí)，水解度的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及控制至關(guān)重要。對(duì)水解過(guò)程建立數(shù)學(xué)模型，便可通過(guò)調(diào)控水解參數(shù)來(lái)控制水解度并對(duì)水解過(guò)程進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。本研究以堿性蛋白酶對(duì)羊骨粉進(jìn)行水解，以水解度為指標(biāo)，建立水解工藝的數(shù)學(xué)模型，并對(duì)水解工藝進(jìn)行優(yōu)化，為以后多肽生產(chǎn)提供參數(shù)，從而提高羊骨附加值及羊養(yǎng)殖業(yè)的綜合效益。

1材料與方法

1.1原料與試劑

羊骨粉以新鮮羊骨自制。堿性蛋白酶(Activity≥200 000 U·L-1,太原科谷儀誠(chéng)商貿(mào)有限公司)；OPA試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，無(wú)水乙醇等其他試劑均為分析純。

1.2儀器設(shè)備

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(廣州雷邁機(jī)械)；802型索式抽提器(天津市玻璃儀器廠)；722G可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Neofuge23R，上海力申科學(xué)儀器有限公司)等。

1.3水解度測(cè)定

OPA(鄰苯二甲醛)法[9]：一個(gè)肽鍵水解會(huì)釋放一個(gè)游離氨基，游離氨基與OPA反應(yīng)形成的黃色絡(luò)合物在340 nm下有最大吸收，在340 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)文獻(xiàn)[9]中的三個(gè)公式計(jì)算水解度。

1.4單因素試驗(yàn)

骨粉中添加一定比例的水及堿性蛋白酶進(jìn)行水解，研究骨粉濃度、溫度、加酶量、酶解時(shí)間、pH對(duì)水解度的影響。酶解結(jié)束后高溫加熱終止反應(yīng)，離心，取上清液測(cè)定水解度，結(jié)果見(jiàn)表1。

1.5響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析法，以水解度為響應(yīng)值(Y)對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化。各響應(yīng)變量的-1、0、+1水平分別為：底物濃度X1(6%、8%、10%)，溫度X2(40 ℃、45 ℃、50 ℃)，時(shí)間X3(4 h、5 h、6 h)，加酶量X4(3%、4%、5%)。各因素水平編碼表見(jiàn)表2。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

酶催化下的蛋白質(zhì)水解過(guò)程是一個(gè)具有動(dòng)態(tài)的平衡的化學(xué)過(guò)程，制備蛋白肽時(shí)，酶解平衡反應(yīng)的效率受多種因素的影響。各因素在不同水平下，骨粉的水解度均先增加后減少或趨于平穩(wěn)(圖略)，為確定水解度所制作的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。表1列舉了每個(gè)單因素試驗(yàn)過(guò)程中水解度達(dá)到峰值時(shí)各因素相對(duì)應(yīng)的水平，并以此作為響應(yīng)面分析的0水平。由表1可以看出，在單因素試驗(yàn)過(guò)程中，水解度逐步增加，最終達(dá)到24.76%。

圖1　絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1　The standard curve of serine

表1堿性蛋白酶單因素試驗(yàn)過(guò)程中水解度(DH%)達(dá)到峰值時(shí)對(duì)應(yīng)的各因素水平

Table 1The level of each factor in corresponding to the peak value of DH by alkaline protease

影響因素Affectingfactor底物濃度Substrateconcen-trationpHpHvalue溫度Temper-ature加酶量Alcalaseamount酶解時(shí)間Hydroly-zingtime水解度峰值/%Peakvalue/%16.618.6322.2823.7924.76水平Level8%945℃4%5h

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2羊骨骨粉堿性蛋白酶水解響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2Design and results of response surface methodology when sheep bone powder was hydrolized by alcalase

試驗(yàn)號(hào)Testnumber料水比Substrateconcen-tration溫度Temper-ature水解時(shí)間Hydroly-zingtime加酶量Enzymeamount水解度/%Degreeofhydrolysis/%10-1-1015.442-10-1020.02301-1023.314000026.645-1-10016.7660-10-119.097001123.978100123.6790-11024.63100-10124.5211-101023.1412010124.1813011023.7614100-121.1115110022.211600-1-119.5517000028.111800-1124.501910-1020.0220000028.32211-10019.4522-100-120.2423001-123.3024010-124.9225-100122.1126101025.2427-110022.32

2.3響應(yīng)面分析

通過(guò)上述回歸方程所作的響應(yīng)值水解度對(duì)各因素的三維曲面圖如圖2所示。由圖2可以看出，骨粉濃度(料水比)、溫度、時(shí)間、pH、加酶量等并非越高(長(zhǎng))越好，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)以節(jié)約生產(chǎn)成本，降低能耗和時(shí)耗為原則，在優(yōu)化的工藝條件下進(jìn)行生產(chǎn)。A～F圖的等高線形狀也可以看出水解溫度(X2)與水解時(shí)間(X3)之間，水解溫度(X2)和加酶量(X4)之間交互作用顯著，其他各因素間的交互作用不顯著。

表3　回歸方程的方差分析結(jié)果

注：**表示差異極顯著，P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。

Note:** means significant difference at 0.01 level(P<0.01) while * means significant at 0.05 level.

2.4模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用Minitab軟件的響應(yīng)優(yōu)化器得到的模型最優(yōu)解，水解度最大預(yù)測(cè)值為28.39%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)考慮到實(shí)際操作的便利，將堿性蛋白酶水解工藝如下修正：料水比由最優(yōu)解9.32%調(diào)整到9%(W/V)、水解溫度由45.25 ℃調(diào)整到45 ℃、水解時(shí)間和加酶量不變，分別為325 min和4.25%(E/S)，在pH9條件下酶解，水解度的平均值為28.12%，進(jìn)一步說(shuō)明該模型可靠。

圖2　羊骨粉堿性蛋白酶水解雙因子交互效應(yīng)分析 Fig.2　Analysis of 2-factor interaction effect during alcalase hydrolysis of sheep bone powder

3討論

3.1水解度測(cè)定方法的選擇

水解度表示蛋白質(zhì)的水解程度，是確定酶解終點(diǎn)的依據(jù)之一[10]。每種水解度測(cè)定方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。甲醛滴定法雖簡(jiǎn)單快速，但測(cè)定結(jié)果往往偏低[8,11]，這是由于脯氨酸(Pro)與甲醛作用生成不穩(wěn)定的化合物[11]。而脯氨酸恰恰是骨膠原和骨膠原肽的特征性氨基酸，含量較高，所以本研究不適合使用甲醛滴定法。茚三酮比色法由于以單一氨基酸做標(biāo)準(zhǔn)也容易造成誤差[8]。雙縮脲比色法操作簡(jiǎn)單快速，測(cè)定微弱酶水解物的水解度時(shí)誤差較小[11]，因此也不適合本研究。pH-Stat法利用時(shí)需用其它方法加以校正，結(jié)果精確度受蛋白酶種類影響很大；三硝基苯磺酸法(TNBS)靈敏度高且不受酶種類影響，但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，不適合對(duì)水解度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[12]。2001年P(guān).M.Nielsen對(duì)TNBS法進(jìn)行改進(jìn)，建立的鄰苯二甲醛法(OPA)比TNBS法更快速更精確，更簡(jiǎn)單、更快速，該法也不受水解度高低的局限[9]。因此本研究選用OPA法對(duì)水解度進(jìn)行測(cè)定，過(guò)程僅需2 min。

3.2羊骨膠原水解度

本研究單因素試驗(yàn)過(guò)程中，水解度隨著各因素的優(yōu)化而逐步提高，最終達(dá)到24.76%，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化，所建數(shù)學(xué)模型的最大預(yù)測(cè)值為28.39%，經(jīng)驗(yàn)證平均值為28.12%，比優(yōu)化前提高了3.36%。詹萍等利用二次旋轉(zhuǎn)正交組合設(shè)計(jì)對(duì)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的雙酶酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，水解度達(dá)到了33.19%[13]，高于本研究結(jié)果，這是由于測(cè)定DH的方法不同所導(dǎo)致的，但確定的最優(yōu)條件與本研究所確定的工藝條件比較接近。其他以水解度為指標(biāo)研究羊骨酶解工藝的報(bào)道很少，其他研究多以制備多肽的活性為指標(biāo)進(jìn)行確定。但蛋白水解物的活性往往是短肽在作用，水解度越高，短肽生產(chǎn)率越高，所制備的多肽可能功能更加全面。有關(guān)其他來(lái)源蛋白質(zhì)的水解工藝確定中，研究者多以水解度為指標(biāo)進(jìn)行篩選。

3.3所建模型與工藝

本研究所建立的數(shù)學(xué)模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度高，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證能比較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)不同酶解條件下的水解度，在以堿性蛋白酶水解制備膠原多肽的過(guò)程中可方便地通過(guò)對(duì)底物濃度、加酶量、酶解溫度和時(shí)間對(duì)水解度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和控制，方便生產(chǎn)。通過(guò)優(yōu)化后的工藝制備的羊骨膠原肽可用作高檔水產(chǎn)飼料的添加劑[14]，或制成多肽營(yíng)養(yǎng)飲料[15]。本研究以骨粉為原料而非對(duì)提取的膠原蛋白進(jìn)行水解，因而減少了污染的機(jī)會(huì)，簡(jiǎn)化了工藝，且盡可能多地保留了骨中的Ca、P等礦物元素。對(duì)通過(guò)本工藝制備的膠原多肽進(jìn)行抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血脂等功能分析，其應(yīng)用性將進(jìn)一步拓展，為羊骨的綜合利用和高值開發(fā)開拓了一條新的途徑，將產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)利益和社會(huì)效益。

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(編輯：馬榮博)