Src激酶抑制劑ZD6474對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制

趙玉濤，楊迎花，趙劍平

(邯鄲市中心醫(yī)院，河北邯鄲 056001)

摘要：目的探討Src激酶抑制劑ZD6474對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，分別加入1×10-6 mol/L、1×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L、1×10-3 mol/L、1×10-2 mol/L的Src激酶抑制劑ZD6474。采用MTT法測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率。采用Transwell法檢測(cè) MCF-7細(xì)胞體外侵襲能力。采用Western blotting法檢測(cè)E-鈣黏素(E-cadherin)及β-連環(huán)蛋白(β-catenin)蛋白表達(dá)。采用報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)Snail啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。采用real-time PCR法檢測(cè)E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)。結(jié)果 ZD6474作用濃度為1×10-5 mol/L和1×10-4 mol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率分別為12.2%和27.5%。MCF-7細(xì)胞經(jīng)ZD6474處理后，體外侵襲能力明顯下降，1×10-6 mol /L、1×10-5 mol/L、1×10-4 mol/L、1×10-3 mol/L、1×10-2mol /LZD6474作用MCF-7細(xì)胞體外侵襲能力分別為8.3%、14.2%、32.6%、51.4%、76.5%。Src激酶抑制劑作用后E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)及Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)。結(jié)論 Src蛋白激酶抑制劑ZD6474可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)E-caherin表達(dá)，下調(diào)β-catenin表達(dá)，減弱Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

關(guān)鍵詞：乳腺癌;Src激酶抑制劑;細(xì)胞增殖

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.005

中圖分類號(hào)：R737.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：河北省衛(wèi)生廳科研

作者簡(jiǎn)介：第一趙玉濤(1977-)，女，主管護(hù)師，主要從事血液腫瘤研究。 E-mail：1909563788@qq.com

作者簡(jiǎn)介：通信趙劍平(1976-)，女，主管護(hù)師，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。E-mail：bairui.lv@hotmail.com

收稿日期：(2015-06-24)

Influence of Src kinase inhibitor ZD6474 on breast cancer

MCF-7 cells and its mechanism

ZHAOYu-tao,YANGYing-hua,ZHAOJian-ping

(HandanCentralHospital，Handan056001，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Src kinase inhibitor ZD6474 on the proliferation of human breast cancer MCF-7 cells and its mechanism. Methods MCF-7 cells in logarithmic phase were treated with different concentrations of Src kinase inhibitor ZD6474 (1×10-6 mol/L, 1×10-5 mol /L, 1×10-4 mol /L, 1×10-3 mol /L and 1×10-2 mol /L). The cell growth inhibition rate was calculated by MTT method. Transwell assay was used to detect the invasion ability of MCF-7 cells in vitro. Western blotting was used to detect the protein expression of Src, E-cadherin and β-catenin. The activity of Snail promoter was detected by reporter gene technology. Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of E-cadherin and β-catenin.ResultsWhen the MCF-7 cells were treated with ZD6474 at the concentrations of 1×10-5 mol/L and 1×10-4 mol/L, the inhibition rates were 12.2% and 27.5%. The invasion ability of MCF-7 cells in vitro was significantly decreased after being treated with ZD6474. The invasion abilities of MCF-7 cells treated with 1×10-6 mol/L, 1×10-5 mol/L,1×10-4 mol/L,1×10-3 mol/L and 1×10-2 mol/L ZD6474 were 8.3%, 14.2%, 32.6%, 51.4% and 76.5%, respectively. Src tyrosine kinase inhibitor significantly up-regulated the expression of E-cadherin at protein and mRNA levels, and down-regulated the expression of β-catenin at protein and mRNA levels as well as promoter activity of Snail.ConclusionSrc kinase inhibitor ZD6474 could inhibit the proliferation of breast cancer cells, up-regulate the activity of E-caherin, down-regulate the expression of β-catenin and decrease the activity of Snail promoter, and thus it inhibits the invasion and metastasis of breast cancer cells.

Key words: breast carcinoma; Src kinase inhibitor; cell proliferation

女性乳腺由皮膚、纖維組織、乳腺腺體和脂肪組成，乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤[1]。乳腺癌中女性占99%，男性僅占1%。乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，僅次于子宮癌[2]。腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變和腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系備受關(guān)注，可使無(wú)侵襲的腫瘤細(xì)胞獲得浸潤(rùn)能力，促進(jìn)腫瘤形成局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[3]。Src基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的人類癌基因。Src蛋白作為非受體酪氨酸激酶，介導(dǎo)黏附因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等多條下游信號(hào)通路[4,5]。2014年9月～2015年4月，我們探討了Src激酶抑制劑ZD6474對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料人乳腺癌MCF-7細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。Src激酶抑制劑ZD6474購(gòu)自AstraZeneea公司；單克隆抗體購(gòu)自Biotech公司；化學(xué)發(fā)光HRP底物購(gòu)自Millipore公司；Real-time PCR系統(tǒng)購(gòu)自ABI公司；Transwell購(gòu)自Costar公司；雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自Promega公司；二甲基亞砜(DMSO)、DMEM 培養(yǎng)基、MTT購(gòu)自Promega公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)算采用 MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，制成懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取5×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度(1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol/L、1×10-2mol/L)的Src激酶抑制劑ZD6474，分別設(shè)置細(xì)胞對(duì)照(對(duì)照組)及空白對(duì)照，每組樣本設(shè)5個(gè)復(fù)孔，溫育48 h后，加入MTT，培養(yǎng)2 h后于490 nm處測(cè)定吸光度值(A值)。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.4MCF-7細(xì)胞體外侵襲能力檢測(cè)采用Transwell法。SRC激酶抑制劑ZD6474處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞48 h后，將8 μm孔徑聚碳酸酯微孔濾膜的Transwell小室4 ℃預(yù)冷后，小室上層均勻平鋪25 μL Matrigel膠，37 ℃孵育3 h。將含5×105個(gè)細(xì)胞的0.1% BSA懸液加到上室，下室加入600 μL的0.1% BSA，37 ℃培養(yǎng)24 h。取出膜，膜上層剩余細(xì)胞，甲醛固定膜下層細(xì)胞，蘇木精染色，高倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，取平均值，計(jì)算百分比。

1.5Src、E-cadherin及β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞接種于直徑10 cm培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的90%時(shí)，給予不同濃度的Src激酶抑制劑ZD6474(1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L)，37 ℃下溫育6 h，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，立即加入300 mL細(xì)胞裂解液，14 000 r/min離心5 min，取上清液，用蛋白分析試劑測(cè)量提取蛋白的濃度。取80 μg蛋白質(zhì)，應(yīng)用12% SDS-PAGE法進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入兔抗人Src酪氨酸磷酸化特異性多克隆抗體1∶500稀釋，鼠抗人E-cadherin單克隆抗體1∶500稀釋，鼠抗人β-catenin單克隆抗體1∶500稀釋，1∶200稀釋的鼠抗人β-actin單克隆抗體作為內(nèi)對(duì)照，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，用含0.1%Tween 20的TBS洗膜，加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)1 h，洗膜后顯色，將條帶結(jié)果進(jìn)行掃描。

1.6Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，接種于6孔板，用不同濃度ZD6474溫育6 h，應(yīng)用Lipofec-tamineTM2000轉(zhuǎn)染pSnail-luc和CMV啟動(dòng)子海腎熒光酶內(nèi)標(biāo)報(bào)告基因載體24 h后，用雙熒光酶測(cè)定試劑盒檢測(cè)Snail啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，計(jì)算螢火蟲熒光酶激發(fā)光子數(shù)目和海腎熒光酶激發(fā)光子數(shù)目的比值。

1.7E-cadherin及β-catenin mRNA表達(dá)檢測(cè)采用real-time PCR法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，接種于6孔板，用不同濃度的Src激酶抑制劑ZD6474在37 ℃條件下溫育6 h，2 000 r/min離心10 min、細(xì)胞收集后用TRIzol抽提總RNA，并將GAPDH作為內(nèi)參照，用以下引物序列擴(kuò)增：GAPDH上游引物序列5′-CCACCCATGGCAAATTCCACTA-3′，下游引物序列5′-GATGGGAATTCCATTGATGACA-3′；β-catenin上游引物序列5′-GCTCTTCGTCATCTGACCAGCC-3′，下游引物序列5′-GAGCAAGGTCACAGAGGACCC-3′； E-cadherin上游引物序列5′-CACTGACACCAACGATAATCC-3′，下游引物序列5′-TCAGTGTGGTGATTACGACGTT-3′。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃，5 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括95 ℃ 5 s、65 ℃ 35 s。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)與方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1ZD6474對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖能力的影響 1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L的ZD6474處理MCF-7細(xì)胞后，MCF-7細(xì)胞增殖明顯受抑，且隨著藥物濃度的加大，細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯，且呈現(xiàn)劑量依賴性。在ZD6474濃度為1×10-6mol/L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L時(shí)，MCF-7細(xì)胞增殖抑制率分別為5.3%、12.1%、27.8%、48.6%、67.3%。

2.2ZD6474 對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外侵襲能力的影響 MCF-7細(xì)胞經(jīng)ZD6474處理后，體外侵襲能力明顯下降，1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol/L、1×10-2mol /L ZD6474作用后，MCF-7細(xì)胞體外侵襲能力分別為8.3%、14.2%、32.6%、51.4%、76.5%。

2.3ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞Src、E-cadherin及β-catenin蛋白表達(dá)的影響MCF-7細(xì)胞經(jīng)ZD6474(1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L)處理后，Src、E-cadherin及β-catenin蛋白表達(dá)呈明顯劑量依賴性(P均<0.05)，結(jié)果見表1、圖1、圖2。

表1　 不同濃度的ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞中Src、

圖1　ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞中Src蛋白表達(dá)的影響

圖2　 ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞中E-cadherin和

2.4ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響ZD6474作用人乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性隨ZD6474濃度的增加而減弱。對(duì)照、1×10-6mol /L、1×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1×10-3mol /L、1×10-2mol /L的ZD6474作用后，MCF-7細(xì)胞Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分別為100%、57.3%、49.6%、35.2%、19.4%、11.2%。

2.5ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞E-cadherin、β-catenin mRNA表達(dá)的影響經(jīng)ZD6474處理后，E-cadherin mRNA表達(dá)呈明顯上升趨勢(shì)，并隨著ZD6474濃度增加，E-cadherin mRNA表達(dá)增加，β-catenin mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì)，并呈劑量依賴性(P<0.05，表2)。

表2　 不同濃度的ZD6474對(duì)MCF-7細(xì)胞中E-cadherin、

3討論

目前乳腺癌已成為威脅女性身心健康的常見腫瘤。臨床應(yīng)用的內(nèi)分泌治療是采用藥物或去除內(nèi)分泌腺體的方法來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌功能[6，7]，減少內(nèi)分泌激素的分泌量，從而達(dá)到治療乳腺癌的目的，乳腺并不是維持人體生命活動(dòng)的重要器官，原位乳腺癌并不致命，但由于乳腺癌細(xì)胞喪失了正常細(xì)胞的特性，細(xì)胞之間連接松散，容易脫落。癌細(xì)胞一旦脫落，游離的癌細(xì)胞可隨血液或淋巴播散全身，形成轉(zhuǎn)移，危及生命[8～10]。盡管近些年來(lái)對(duì)乳腺癌的研究已取得了很大進(jìn)展，但對(duì)于其發(fā)病機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚。

惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。Src基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的人類癌基因。Src蛋白作為非受體酪氨酸激酶，介導(dǎo)生長(zhǎng)因子、黏附因子、趨化因子等多條下游信號(hào)通路[10]。乳腺癌組織中Src表達(dá)顯著升高，且常存在異?；罨閷?dǎo)下游多條信號(hào)通路的改變。Src的過(guò)度表達(dá)和活化在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成、細(xì)胞增殖、生存、遷移及侵襲等方面起重要作用[11～13]。ZD6474作為Src 激酶抑制劑，迄今鮮見其對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制研究[14]。Src是一種膜相關(guān)的無(wú)需受體的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白激酶，在各類細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附分子接頭中大量存在于肝癌細(xì)胞中。E-cadherin的胞質(zhì)區(qū)域通過(guò)細(xì)胞質(zhì)蛋白與細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白絲相連，亦是細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制因子，能降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[15～17]。因此，本研究通過(guò)ZD6474處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，然后檢測(cè)其增殖和轉(zhuǎn)移能力的變化，從而闡明ZD6474對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用。Src 激酶在多數(shù)惡性腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，在外界信號(hào)通過(guò)細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程中，Src 活化并磷酸化細(xì)胞內(nèi)大量的酶作用底物，通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)到E-caherin，最終影響細(xì)胞間黏附能力。

本研究我們發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)ZD6474處理后，Src、β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin 表達(dá)水平顯著增高。通過(guò)腫瘤細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)和體外侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)ZD6474處理后，黏附及侵襲能力顯著下降，且呈濃度依賴性。MTT試驗(yàn)檢測(cè)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示ZD6474能明顯抑制細(xì)胞的增殖。

Snail是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，與腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。沉默腫瘤細(xì)胞中Snail表達(dá)能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲。乳腺癌細(xì)胞MCF-7被Src特異性阻斷劑作用后，Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性隨阻斷劑濃度的增加而減弱，提示Snail高表達(dá)與乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，這些現(xiàn)象表明如果抑制Src激酶表達(dá)，有可能使 E-caherin表達(dá)上調(diào)，降低惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，Src激酶抑制劑ZD6474對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖有良好的抑制作用，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)E-caherin表達(dá)，下調(diào)β-catenin表達(dá)，減弱Snail啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

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