Survivin基因沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響

曹洪華

(貴港市人民醫(yī)院，廣西貴港537100)

摘要：目的觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞中Survivin的表達(dá)情況，及Survivin基因沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。方法培養(yǎng)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460及結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480，將SW480細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(留取部分細(xì)胞待測Survivin mRNA及蛋白)，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染Survivin siRNA，對(duì)照組轉(zhuǎn)染control siRNA。檢測NCM460細(xì)胞、SW480細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞中的Survivin mRNA及蛋白；實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組轉(zhuǎn)染48 h后，采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞增殖能力，Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。結(jié)果NCM460細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.16±0.10、0.20±0.15，SW480細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，二者相比，P均<0.05。轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.20±0.13、0.31±0.12，對(duì)照組細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，兩組相比，P均<0.05。兩組轉(zhuǎn)染48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組每視野穿膜細(xì)胞數(shù)為(140±15)個(gè)，對(duì)照組為(27±6)個(gè)，兩組相比，P<0.05。結(jié)論Survivin基因沉默可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌；直腸癌；生存素；基因沉默技術(shù)；細(xì)胞增殖；細(xì)胞遷移

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.39.009

中圖分類號(hào)：R735.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-06-05)

近年來，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長趨勢[1，2]。研究表明，結(jié)直腸癌的形成和轉(zhuǎn)移是多基因、多因素共同作用的結(jié)果。Survivin為凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成員之一，能抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的有絲分裂，并可能參與血管形成。Survivin在多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3，4]。2014年12月~2015年3月，我們通過在結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480中轉(zhuǎn)染siRNA，沉默Survivin基因，觀察腫瘤細(xì)胞增殖及遷移能力的變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460和結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞研究所。所有抗體購自Abcam公司。siRNA購自上海吉?jiǎng)P基因公司。胎牛血清和胰蛋白酶購自Invitrogen公司。L-15、RPMI-1640、McCoy′5A購自Gibco公司。RNA提取試劑TRIzol購自上海Fastagen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Toyobo公司。PCR相關(guān)試劑購自北京天為公司。real-time PCR儀購自Eppendorf公司。PVDF膜、封閉液、洗脫液、脫脂奶粉、蛋白提取液及相關(guān)試劑購自碧云天生物研究所。450型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞分組與Survivin siRNA轉(zhuǎn)染方法正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞株NCM460常規(guī)培養(yǎng)于含有15%胎牛血清的DMEM中。結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞在感染前1 d用胰蛋白酶消化傳代，使其在轉(zhuǎn)染當(dāng)天融合率為30%~50%。將SW480細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(留取部分細(xì)胞待測Survivin mRNA及蛋白)，其中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染Survivin siRNA，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h(實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)6~8 h后，將含siRNA-Lipofectamine2000混合液的培養(yǎng)基移去，換為新鮮的生長培養(yǎng)基)，檢測沉默效果，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3Survivin mRNA及蛋白檢測①Survivin mRNA檢測：按TRIzol試劑盒說明書步驟，抽提NCM460細(xì)胞、SW480細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，并利用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，通過RT-PCR生成cDNA；以cDNA作為模板，采用real-time PCR檢測Survivin mRNA；Survivin上游引物序列為5′-GCATGGGTCCCCCGACGTTG-3′、下游引物序列為5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′，內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-TCAACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3′、下游引物序列為5′-TCCTGGAAGATGGTGATGGGATTT-3′；反應(yīng)條件為95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，55 ℃退火1 min，循環(huán)40 次；各樣本重復(fù)測量3次，根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。②Survivin蛋白檢測：收集NCM460細(xì)胞、SW480細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，加入裂解液冰浴30 min，離心后取上清并測定蛋白濃度；分別取50 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，加入5%脫脂奶粉封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉2 h，加Survivin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗兔IgG(二抗)，37 ℃孵育1 h，ECL 熒光顯色，使用Quantity One4.2軟件計(jì)算蛋白條帶的灰度值。待測蛋白表達(dá)量=待測蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.4SW480細(xì)胞增殖能力檢測轉(zhuǎn)染48 h后取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)6、12、24、48、72 h每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，4 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)終止，振蕩15 min，450型酶標(biāo)儀570 nm波長下檢測吸光度值(OD值)，以此反映細(xì)胞增殖能力。

1.5SW480細(xì)胞遷移能力檢測實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，吸出培養(yǎng)板中殘余液體，消化細(xì)胞后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1~2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell 小室，下室加入900 μL 含10% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。用0.4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干10 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min后，用PBS清洗并晾干。將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下觀察4個(gè)視野并照相，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1NCM460細(xì)胞、SW480細(xì)胞中Survivin mRNA及蛋白表達(dá)情況NCM460細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.16±0.10、0.20±0.15，SW480細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，二者相比，P均<0.05。

2.2實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞中Survivin mRNA及蛋白表達(dá)情況轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.20±0.13、0.31±0.12，對(duì)照組細(xì)胞中Survivin mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.00±0.00，兩組相比，P均<0.05。

2.3實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較兩組轉(zhuǎn)染48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h細(xì)胞增殖能力相比，P均<0.05。見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較(OD值， ± s)

表1　實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞增殖能力比較(OD值， ± s)

組別細(xì)胞增殖能力6h12h24h48h72h實(shí)驗(yàn)組0.24±0.030.32±0.100.53±0.081.07±0.201.43±0.35對(duì)照組0.25±0.050.53±0.08*1.31±0.41*1.89±0.43*2.20±0.32*

注：與實(shí)驗(yàn)組相比，P<0.05。

2.4實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞遷移能力比較實(shí)驗(yàn)組每個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)為(140±15)個(gè)，對(duì)照組為(27±6)，兩組相比，P<0.05。

3討論

結(jié)直腸癌目前采用手術(shù)切除為主、放化療為輔的綜合治療，但中晚期結(jié)直腸癌治療效果并不理想。Survivin是一種凋亡抑制蛋白，是凋亡抑制因子中作用最強(qiáng)的一種，具有參與調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡的作用[5，6]。Survivin主要在G2/M期表達(dá)，G2/M期控制點(diǎn)負(fù)責(zé)保持遺傳的準(zhǔn)確性，通過Survivin對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用，使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期G2/M期檢測點(diǎn)的監(jiān)測，從而抵抗因DNA損傷或突變自身誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常分裂增殖[7]。在生理狀態(tài)下，Survivin僅表達(dá)于成人分泌期子宮內(nèi)膜、胎盤、睪丸、胸腺及胚胎組織中；病理狀態(tài)下，Survivin廣泛表達(dá)于各種惡性腫瘤組織中, 如胃癌、食管癌、肝癌、膀胱癌、肺癌等[8~11]，其高表達(dá)與患者的短生存率、預(yù)后不良及化放療抵抗有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，SW480細(xì)胞中Survivin基因和蛋白呈高表達(dá)，而在NCM460細(xì)胞中呈低表達(dá)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[13]。研究[14，15]表明，Survivin表達(dá)發(fā)生在結(jié)直腸腺癌惡性轉(zhuǎn)化的早期，在癌變過程中起重要作用。Survivin的表達(dá)上調(diào)與直腸癌細(xì)胞凋亡指數(shù)下降、轉(zhuǎn)移率增高、患者總體生存期縮短、預(yù)后不良有關(guān)[16]。

siRNA是一種短片段雙鏈RNA 分子，能以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，導(dǎo)致相應(yīng)基因沉默[17]。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞MCF7中，轉(zhuǎn)染siRNA能抑制Survivin mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)還能抑制細(xì)胞增殖及凋亡。本研究結(jié)果顯示，在SW480細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA后，Survivin mRNA及蛋白的表達(dá)明顯降低。我們檢測細(xì)胞增殖及遷移能力后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖及遷移能力均低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明轉(zhuǎn)染Survivin siRNA后，SW480細(xì)胞的增殖、遷移能力受到抑制，抑制腫瘤細(xì)胞中Survivin的表達(dá)可能是腫瘤基因治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

總之，我們發(fā)現(xiàn)，Survivin基因及蛋白在結(jié)直腸細(xì)胞中高表達(dá)，沉默Survivin基因能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。鑒于Survivin基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的特性，通過RNAi技術(shù)，可抑制特定序列Survivin mRNA表達(dá)，結(jié)合手術(shù)治療，有望提高結(jié)直腸癌的治療效果，延長患者生命。

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