·論著·

穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的AR42J細(xì)胞系的建立

吳敏李潔劉曉李欽芳郭曉榕湛先保

【摘要】目的建立穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型GFP(EGFP)-LC3的AR42J細(xì)胞。方法利用慢病毒過(guò)表達(dá)載體Lentiviral-EGFP-LC3包裝成慢病毒，感染大鼠胰腺腺泡細(xì)胞AR42J。以Lentiviral-EGFP感染作為陰性對(duì)照。通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)病毒感染效率，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)穩(wěn)定傳代細(xì)胞株的LC3蛋白表達(dá)。用毒胡蘿卜素處理細(xì)胞建立內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)應(yīng)激的AR42J細(xì)胞的LC3、PERK蛋白表達(dá)。結(jié)果AR42J細(xì)胞的Lentiviral-EGFP-LC3感染效率>85%，并能穩(wěn)定傳代。Lentiviral-EGFP-LC3感染的AR42J細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)量為未感染細(xì)胞的(9.14±0.32)倍；LC3蛋白陽(yáng)性表達(dá)并有EGFP-LC3融合蛋白的表達(dá)。Lentiviral-EGFP感染的AR42J細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)量為未感染細(xì)胞的(1.08±0.07)倍，無(wú)LC3蛋白表達(dá)，僅有GFP表達(dá)。與未感染組比較，EGFP-LC3組的LC3 mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而EGFP組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J，為進(jìn)一步研究急性胰腺炎與自噬的關(guān)系提供了新的細(xì)胞模型。

【關(guān)鍵詞】慢病毒感染；自噬；細(xì)胞系；AR42J細(xì)胞

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.011

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81170434，81370571)

收稿日期：(2015-01-03)

Establishment of a stable AR42J cell line expressing EGFP LC3WuMin,LiJie,LiuXiao,LiQinfang,GuoXiaorong,ZhanXianbao.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:ZhanXianbao,Email:zhanxianbao@126.com

Abstract【】ObjectiveTo establish a stable AR42J cell line expressing EGFP LC3. MethodsThe EGFP LC3 overexpressed Lentivirus was constructed and transfected into pancreatic acinar cells (AR42J) of rats. The rats with Lentiviral EGFP transfection were treated as negative control. The transfection efficiency was detected by inverted fluorescence microscope and flow cytometry. The EGFP LC3 protein expression in the stable cell lines were analyzed by Western blot. The cells were treated with thapsigargin to establish endoplasmic reticulum stress model, and the LC3, PERK protein expressions were detected by Western blot. ResultsThe transfection efficiency of Lentiviral EGFP LC3 of AR42J cell was >85%, which could achieve stable passage. The expression of LC3 mRNA of AR42J cells transfected with Lentiviral EGFP LC3 was 9.14±0.32 folds higher than that of negative control, which had no expression of LC3 protein, only EGFP expression. However, compared with non-transfection group, the LC3 mRNA expression in EGFP group was not significantly different. ConclusionsA pancreatic acinar cell line (AR42J) of rat stably expressing EGFP LC3 protein is successfully constructed. And it may provide a new model for further research of the relationship between acute pancreatitis and autophagy.

【Key words】Lentivirus infections;Autophagy;Cell line;AR42J cell

自噬是細(xì)胞內(nèi)過(guò)多或異常的細(xì)胞器及其周?chē)牡鞍踪|(zhì)和部分細(xì)胞質(zhì)被雙層膜所包裹形成自噬體，自噬體與溶酶體融合并且降解其所包裹的內(nèi)容物，隨后降解產(chǎn)物(如氨基酸)反向循環(huán)至細(xì)胞質(zhì)的過(guò)程。通常細(xì)胞內(nèi)自噬維持在很低的水平，在應(yīng)激條件下可被誘導(dǎo)，它在細(xì)胞內(nèi)具有各種各樣的功能[1-3]。LC3是酵母自噬相關(guān)基因ATG8的類(lèi)似物，當(dāng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3由可溶形式LC3(LC3-Ⅰ)轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄问絃C3(LC3-Ⅱ)，LC3-Ⅱ能夠與新形成的自噬體膜結(jié)合。檢測(cè)細(xì)胞中LC3Ⅱ含量的變化可以判斷自噬的變化。因此，本研究利用過(guò)表達(dá)LC3的慢病毒載體Lentiviral-EGFP-LC3轉(zhuǎn)染大鼠胰腺外分泌細(xì)胞AR42J，并通過(guò)模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，以明確在AR42J細(xì)胞進(jìn)行自噬研究的可能性，為進(jìn)一步研究急性胰腺炎與自噬的關(guān)系提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型。

作者單位：200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

通信作者：湛先保，Email：zhanxianbao @126.com

材料與方法

一、材料、試劑和儀器

Lentiviral-EGFP-LC3慢病毒載體及陰性對(duì)照慢病毒載體Lentiviral-EGFP由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室提供。AR42J細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gbico公司、1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；小鼠抗大鼠β-actin單抗購(gòu)自杭州華安生物技術(shù)有限公司、小鼠抗大鼠GFP單抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、兔抗大鼠LC3單抗購(gòu)自美國(guó)CST公司、兔抗大鼠PERK多抗購(gòu)自美國(guó)Santa-Cruz公司；DMSO、毒胡蘿卜素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；流式細(xì)胞分析儀購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；ABI7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

二、方法

1．慢病毒包裝及滴度檢測(cè)：人源胚胎腎細(xì)胞(HEK293T細(xì)胞)由本實(shí)驗(yàn)室提供，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2.5×106個(gè)細(xì)胞密度接種于10 cm培養(yǎng)瓶，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜。感染前2至3 h更換新鮮培養(yǎng)基，將Lentiviral-EGFP-LC3、包膜質(zhì)粒pCMV-VSV -G、包裝質(zhì)粒pCMV-Dr8.2dvpr(均為美國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品)與HEK293T細(xì)胞共孵育24 h，按說(shuō)明書(shū)操作。以Lentiviral-EGFP感染作為陰性對(duì)照，慢病毒包裝后置-80℃冰箱保存[4]。兩種病毒分別命名為EGFP-LC3病毒及EGFP病毒，并運(yùn)用稀釋梯度法檢測(cè)病毒滴度。

2．慢病毒感染：AR42J細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成1×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液。在24孔板中每孔加入500 μl細(xì)胞懸液，即每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜。AR42J細(xì)胞分為未感染組、EGFP病毒感染組(EGFP組)、EGFP-LC3病毒感染組(EGFP-LC3組)。

分別取兩種病毒液，加入培養(yǎng)液混懸，病毒滴度為1×108TU/ml，再加入終濃度為7 μg/ml的聚凝胺(polybrene)，混勻后加入到相應(yīng)組的AR42J細(xì)胞中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，隨后更換培養(yǎng)液。48 h后在倒置熒光顯微鏡下任意選取10個(gè)視野，分別于10倍鏡、20倍鏡下觀察GFP表達(dá)效率，同時(shí)取50 μl細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)感染效率。

3．細(xì)胞GFP、LC3蛋白表達(dá)檢測(cè)：收集未轉(zhuǎn)染組、EGFP組、EGFP-LC3組細(xì)胞，應(yīng)用RIPA裂解液勻漿細(xì)胞，提取蛋白，定量后取50 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞GFP、LC3蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。小鼠抗大鼠GFP單抗稀釋濃度為1∶1 000，兔抗大鼠LC3單抗稀釋濃度為1∶1 000，內(nèi)參小鼠抗大鼠β-actin單抗稀釋濃度為1∶1 000；HRP標(biāo)記二抗稀釋濃度1∶5 000。最后ECL發(fā)光，X線膠片曝光、顯影、定影。

4．細(xì)胞LC3 mRNA表達(dá)檢測(cè)：收集未感染組、EGFP組、EGFP-LC3組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再按PCR試劑盒擴(kuò)增LC3 mRNA。LC3引物上游為5′-CGGAGCTTTGAACAAAGAGTGG-3′，下游為5′-CTCTCTCACTCTCGTACAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物177 bp，由上海Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。通過(guò)PCR儀自帶分析軟件獲取Ct值，應(yīng)用公式2-△△Ct計(jì)算LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，以未感染組細(xì)胞的表達(dá)量為1。

5．內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型建立及評(píng)估：將穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的AR42J細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后分為未處理組及毒胡蘿卜素(TG)處理組，TG處理組加入1 μmol/L的毒胡蘿卜素處理12 h。收集兩組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因PERK蛋白的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。兔抗鼠PERK多抗稀釋濃度為1∶400，其他操作同上。應(yīng)用圖像分析儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

一、AR42J細(xì)胞的病毒感染率及其傳代的穩(wěn)定性

感染48 h后熒光顯微鏡下觀察，兩組病毒感染的AR42J細(xì)胞絕大多數(shù)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)熒光蛋白GFP(圖1)，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)到兩組病毒感染細(xì)胞的感染效率均在85%以上(圖2)。陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞經(jīng)10次傳代培養(yǎng)，未見(jiàn)GFP熒光衰減，表明病毒感染的AR42J細(xì)胞能穩(wěn)定地傳代。

圖1　Lentiviral-EGFP-LC3感染的明視野(1A)及暗視野熒光圖(熒光顯微鏡　×20)

FSC是前向角散射，SSC是側(cè)向角散射，A為細(xì)胞熒光的總和 圖2　Lentiviral-EGFP-LC3感染(2A、2B)及Lentiviral-EGFP 感染(2C、2D)的 AR42J細(xì)胞EGFP表達(dá) (流式細(xì)胞分析儀)

二、AR42J細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)

未感染組的LC3 mRNA的表達(dá)量為1，EGFP組、EGFP-LC3組細(xì)胞的LC3 mRNA表達(dá)量分別為未感染組細(xì)胞的 (1.08±0.07)、(9.14±0.32)倍。EGFP-LC3組的表達(dá)量顯著高于未感染組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.293，P<0.01)，而EGFP組與未感染組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的GFP、LC3蛋白表達(dá)

未感染組無(wú)GFP、LC3蛋白表達(dá)。EGFP組、EGFP-LC3組細(xì)胞有GFP蛋白的表達(dá)。EGFP-LC3組細(xì)胞還有EGFP-LC3融合蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3　未感染組(1)、EGFP組(2、3)、EGFP-LC3組(4、5)AR42J細(xì)胞的GFP、LC3、GFP-LC3蛋白的表達(dá)

四、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的AR42J細(xì)胞LC3、PERK蛋白的變化

未處理組與TG處理組AR42J細(xì)胞均可檢測(cè)出LC3、PERK的表達(dá)(圖4)。兩組LC3及PERK蛋白相對(duì)含量LC3-Ⅰ為0.273±0.01、0.176±0.03，LC3-Ⅱ?yàn)?.156±0.03、0.546±0.04，PERK為0.284±0.02、0.648±0.06。表明TG處理組細(xì)胞中LC3-I向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變，PERK蛋白的表達(dá)較未處理組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值分別為56.14、386.96、150.84，P<0.01，圖4)。

圖4未處理組(1)、TG處理組(2)的Lentivard-EGFP-LC3感染的AR42J細(xì)胞的LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、PERK蛋白的表達(dá)

討　　論

自噬參與細(xì)胞的生理活動(dòng)，例如細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。自噬還可能參與調(diào)節(jié)一些人類(lèi)疾病的過(guò)程，例如癌癥、肌肉疾病和神經(jīng)退行性疾病。它還可以作為一種細(xì)胞防御機(jī)制防止某些病原菌和病毒的感染[5-6]。自噬是一個(gè)受到緊密調(diào)控的過(guò)程，它在細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中起著重要的作用。因此構(gòu)建適合的細(xì)胞模型對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究尤為重要。

自噬體的形成由一系列自噬相關(guān)基因(autophagy-related genes，ATG)的產(chǎn)物組成的復(fù)合物參與協(xié)調(diào)[7-8]。ATG編碼的蛋白質(zhì)至少組成4種復(fù)合物，它們各自控制自噬體形成過(guò)程中單獨(dú)的環(huán)節(jié)。例如，ULK1/Atg1參與自噬體的成核，Beclin1/Atg6-Vps34和Atg5-Atg12-Atg16復(fù)合物參與隔離膜的形成[9-10]。

大鼠胰腺外分泌細(xì)胞對(duì)于研究急性胰腺炎的分子機(jī)制是一種重要的細(xì)胞模型。既往一些研究證實(shí)，利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)可以使外源性基因的表達(dá)在24～48 h內(nèi)達(dá)到高峰，然而隨著時(shí)間的推移，由于細(xì)胞裂解等因素的影響，可能會(huì)引起外源性基因的缺失，對(duì)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。同時(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可持續(xù)傳代，既提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，又降低了多次轉(zhuǎn)染的試驗(yàn)成本。因此，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3融合蛋白的AR42J細(xì)胞可以保證細(xì)胞的持續(xù)性以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒過(guò)表達(dá)載體包裝慢病毒以感染AR42J細(xì)胞，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞分析儀對(duì)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，綠色熒光蛋白的表達(dá)在85%以上。再利用蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中EGFP-LC3融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明細(xì)胞中成功表達(dá)EGFP-LC3融合蛋白。同時(shí)建立TG誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，蛋白印跡法檢測(cè)顯示LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變明顯。以上表明在AR42J細(xì)胞系中可通過(guò)TG誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型的建立，同時(shí)表明在AR42J細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可引起自噬的變化。此外，在小鼠RAW264．7細(xì)胞系、成神經(jīng)瘤細(xì)胞系等均觀察到一致的結(jié)果。此次建立穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的AR42J細(xì)胞系，為下一步研究急性胰腺炎與自噬關(guān)系提供了重要的研究模型。

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(本文編輯：呂芳萍)

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