■高肖微 齊遵利 張秀文

（河北農(nóng)業(yè)大學海洋學院，河北秦皇島 066003）

在飼料中添加抗生素對水產(chǎn)動物的生長和疾病預防有一定的促進作用，但同時也會導致耐藥菌株的產(chǎn)生，破壞動物體內(nèi)微生態(tài)平衡，使動物體非特異性免疫能力下降[1-2]。近幾年人們一直在尋找抗生素的替代品，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）具有促進腸道內(nèi)厭氧菌的生長、抑制致病菌的生長繁殖、調(diào)整腸道菌群平衡和促進食物消化吸收的作用，并且滿足耐高溫、耐酸堿等飼料加工特性，具有無殘留、無毒副作用，避免了使用抗生素的一些弊端。研究地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑的使用越來越引起人們的重視。本試驗在鯉魚飼料中添加地衣芽孢桿菌，探討其對鯉魚生長性能、非特異性免疫酶活性的影響，為地衣芽孢桿菌在鯉魚養(yǎng)殖中的應用提供依據(jù)。

1 試驗材料

試驗用鯉魚來自天津市換新水產(chǎn)良種場。試驗魚先暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間，投喂飼料為基礎飼料，以鯉魚出現(xiàn)有規(guī)律攝食為馴化指標。試驗用地衣芽孢桿菌來自江蘇納克生物工程有限公司，活菌數(shù)為3×1010cfu/g。

2 方法

2.1 試驗設計與管理

試驗在110 cm×45 cm×60 cm的水族箱內(nèi)進行。將地衣芽孢桿菌按照0%（對照組）、0.05%（A1）、0.1%（A2）、0.2%（A3）的比例加入到基礎飼料中制成試驗飼料，每組3個平行，每個水族箱內(nèi)放20尾試驗魚。每天08:30、12:30和16:30定時投喂，投喂量約為體重的3%。每天檢查鯉魚的攝食、發(fā)病或死亡情況，做好記錄。水溫控制在25℃左右，根據(jù)水質情況適當換水，每次換水量為1/5。連續(xù)投喂60 d。

2.2 生長指標的測定

試驗正式開始后，分別測定對照組和試驗組的鯉魚初始體重，飼喂60 d后，停食1 d，空腹測定終末體重。計算各組魚的相對增重率和飼料系數(shù)。

飼料系數(shù)（CF）=飼料消耗量/魚的增重量；

相對增重率（%）=（試驗末魚平均尾重量－試驗初魚平均尾重量）/試驗初魚平均尾重量×100。

2.3 生化指標的測定

試驗開始后在20、40、60 d，從每個試驗處理組隨機取3尾魚，用肝素鈉水溶液潤洗過的一次性注射器在魚的尾靜脈采血2 ml，立即輕輕搖勻，置于4℃冰箱內(nèi)保存。3 000 r/min冷凍離心10 min后，提取血清。24 h內(nèi)測定完畢。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、溶菌酶（LZM）、谷草轉氨酶（GOT）的活性均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

超氧化物歧化酶（SOD）活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，1個SOD活性單位（U）定義：1 ml血清反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為1個活性單位；溶菌酶（LZM）的活性：在溫度為37℃、波長為530 nm下，1 min內(nèi)引起吸光度下降0.001為1個活性單位；過氧化氫酶（CAT）的活性定義為：1 ml血清或血漿1 s分解1 μmol的H2O2的量為1個活性單位（U）；堿性磷酸酶（AKP）活性單位的定義：100 ml血清在37℃與基質作用15 min時產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位；酸性磷酸酶（ACP）的活性：100 ml血清在37℃與基質作用15 min時產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位；谷草轉氨酶（GOT）活性采用比色法測定，以絕對OD值，查標準曲線，求得相應的GOT活性單位。

2.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)處理，運用ANOVA單因素方差分析及Duncan's多重比較法對試驗結果進行顯著性檢驗，試驗結果用“平均值±標準差（mean±SD）”表示，顯著水平為P＜0.05。

3 結果與分析

3.1 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯉魚生長性能的影響（見表1）

表1 地衣芽孢桿菌對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，與對照組相比，鯉魚的生長性能顯著增強（P＜0.05），其中0.1%組效果最好，相對增重率和飼料系數(shù)分別為156.57%、1.58，且顯著高于A1和A3組（P＜0.05），A1與A3組之間差異不顯著（P＞0.05）。

3.2 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯉魚生化指標的影響（見表2及圖1、圖2）

3.2.1 對SOD的影響

由表2可知，投喂20 d：地衣芽孢桿菌能顯著提高鯉魚SOD活性（P＜0.05），3個試驗組較對照組分別提高29.53%、55.5%、47.84%。與A1組相比，A2、A3組顯著提高了鯉魚抗氧化能力（P＜0.05）；投喂 40 d：試驗組SOD活性與對照組相比較差異顯著（P＜0.05），試驗組之間差異顯著（P＜0.05），A2組SOD活性最高，較對照組高出61.67 U/ml；投喂60 d：3個試驗組之間差異不顯著（P＞0.05），但是同對照組有顯著性差異（P＜0.05）。

3.2.2 對LZM的影響

表2 地衣芽孢桿菌對鯉魚血清SOD、LZM、CAT活性的影響（U/ml）

圖1 地衣芽孢桿菌對鯉魚血清ACP和AKP活性的影響

圖2 地衣芽孢桿菌對鯉魚血清GOT活性的影響

由表2可知，投喂20 d：地衣芽孢桿菌對鯉魚LZM影響較小（P＞0.05）；投喂40 d：3個試驗組的LZM活性與對照組相比差異顯著（P＜0.05），較對照組提高28.67%、31.96%、33.29%，試驗組之間差異不顯著（P＞0.05），添加0.2%地衣芽孢桿菌組效果較好；投喂60 d：試驗組同對照組差異顯著（P＜0.05），A1與A3差異不顯著（P＞0.05），與A2有顯著差異 （P＜0.05）。A2組LZM活性達到最高，為88.83 U/ml，較對照組提高39.87%。

3.2.3 對CAT的影響

由表2可知，整個試驗期間各個試驗組CAT呈現(xiàn)增高的趨勢。投喂20 d：試驗組與對照組差異顯著（P＜0.05），其中A1和A2組CAT活性差異不顯著（P＞0.05），均與A3組CAT活性差異顯著（P＜0.05）；投喂40 d：3個試驗組的CAT活性和對照組相比差異顯著（P＜0.05），A2、A3組CAT活性差異不顯著（P＞0.05）。投喂60 d：4個組之間CAT活性差異顯著（P＜0.05）。A3組CAT活性達到最高，為5.87 U/ml，相比對照組增加了86.35%。

3.2.4 對ACP和AKP的影響

由圖1可知，對照組和試驗組鯉魚的ACP和AKP活性，隨著投喂時間的增加稍微有所增強。ACP活性：投喂20 d，試驗組和對照組ACP活性差異顯著（P＜0.05），A1和 A3差異不顯著（P＞0.05），與 A2差異顯著（P＜0.05）；投喂40 d和60 d效果相同，試驗組之間差異不顯著（P＞0.05），但同對照組相比差異顯著（P＜0.05）。AKP活性：投喂20 d和40 d試驗組和對照組AKP活性差異顯著（P＜0.05），A1和A3差異不顯著（P＞0.05），與A2差異顯著（P＜0.05）；投喂60 d，試驗組之間差異不顯著（P＞0.05），但同對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

3.2.5 對GOT的影響

由圖2可知，整個試驗期間隨著投喂地衣芽孢桿菌飼料時間的增加，試驗組和對照組的GOT活性稍有降低或升高，但沒有顯著差異（P＞0.05）。投喂地衣芽孢桿菌20 d時，與對照組相比，除A3組外，A1與A2組稍有升高；40、60 d后，試驗組GOT活性呈降低趨勢。

4 討論

4.1 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯉魚生長的影響

從表1可以看出，地衣芽孢桿菌添加劑能夠降低飼料系數(shù)，提高試驗組鯉魚相對增重率。地衣芽孢桿菌隨添加量增加，增重率呈現(xiàn)先增加，而后略有降低的趨勢；飼料系數(shù)先降低，然后升高。其中添加地衣芽孢桿菌0.1%（A2），增重率最大，飼料系數(shù)最低。這一結果與劉波等[3]研究地衣芽孢桿菌對異育銀鯽生長的影響和華雪銘等[4]研究飼料添加芽孢桿菌對異育銀鯽的生長及抗病力的影響所得結果相似。這可能是地衣芽孢桿菌進入腸道后產(chǎn)生了多肽、維生素、氨基酸等多種營養(yǎng)物質，同時產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、纖維素酶等[5]，這些酶進入宿主腸道后，增加宿主內(nèi)源酶數(shù)量和消化酶活性，使動物腸道褶皺增多，增強腸黏膜細胞吸收能力[6]，維持和調(diào)節(jié)魚體腸道菌群平衡，減少降解膽酸的細菌數(shù)量[7-8]，從而促進動物生長。

4.2 飼料中添加地衣芽孢桿菌對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗結果顯示，在飼料中添加0.05%～0.2%地衣芽孢桿菌可以顯著提高ACP和AKP活性（P＜0.05），且20 d時A2組ACP、AKP活性顯著高于A1和A3組（P＜0.05），40 d時A2組AKP活性顯著高于A1和A3組（P＜0.05），說明在飼料中添加地衣芽孢桿菌可以提高鯉魚免疫力，其中以0.1%添加組效果最好。谷草轉氨酶（GOT）的活性試驗組與對照組沒有顯著差異（P＞0.05），說明試驗采樣鯉魚的肝胰臟等組織沒有發(fā)生病變[9]，避免了在魚患病時取樣，從而引起非試驗條件的生化指標的差別，也說明在試驗期間對鯉魚肝胰臟未造成明顯損傷。

有學者研究發(fā)現(xiàn)：用添加枯草芽孢桿菌的飼料投喂鯉魚，可以促進鯉魚免疫器官的成熟，增加鯉魚的巨噬細胞呼吸爆發(fā)活性和抗嗜水氣單胞菌的能力[10]。魚蝦等生物在抵抗外來入侵病菌或條件致病菌時，其非特異性免疫在清除異物時發(fā)揮著重要作用。研究表明凡納濱對蝦SOD具有免疫調(diào)節(jié)活性，可以用來評價機體免疫能力高低[11]。芽孢桿菌添加到一定量時，南美白對蝦的SOD等免疫指標比對照組提高幾倍[12]。

本試驗通過投喂不同劑量的地衣芽孢桿菌飼料發(fā)現(xiàn)：投喂20 d時，地衣芽孢桿菌能顯著提高鯉魚SOD、CAT活性（P＜0.05），分別比對照組提高29.53%、55.5%、47.84%和33.75%、46.25%、62.08%。而對LZM影響較?。≒＞0.05）；投喂40 d：SOD、CAT、LZM活性顯著高于對照組（P＜0.05），A2組SOD最高，為168.38 U/ml，A3組CAT和LZM活性最高，分別為4.79 U/ml和82.28 U/ml。投喂60 d時，隨著地衣芽孢桿菌添加量的增加，鯉魚免疫機能不同程度顯著提高（P＜0.05）。

本試驗中試驗組鯉魚血清生化指標的變化，同地衣芽孢桿菌對三角帆蚌免疫機能的影響[13]和Harikrishnan等[14]研究芽孢桿菌對牙鲆免疫機能影響，以及沈文英等[15]研究飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚免疫功能的影響所報道的結果相似，表現(xiàn)為血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性均顯著高于對照組，表明芽孢桿菌對鯉魚體液免疫因子產(chǎn)生明顯影響，有利于增強鯉魚抗病力。本試驗通過向飼料中添加地衣芽孢桿菌，顯著增加了血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性。說明在基礎飼料中添加不同劑量的地衣芽孢桿菌能提高鯉魚的免疫力和抗病力，其中添加0.1%（A2組）就可以最大降低飼料系數(shù)，提高增重率，同時增加鯉魚的免疫能力。

對于地衣芽孢桿菌對鯉魚生長和免疫的影響機制，需要進一步做組織學和基因組學研究。