■王 全 李紅亞 李術(shù)娜 王 會 朱寶成

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001；2.衡水市農(nóng)機管理總站,河北衡水 053000）

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase），又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶，屬于水解酶[1]。它能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基[2]。

1837年，Liebig等首次在苦杏仁中發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶。后來的研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶存在于自然界許多植物、昆蟲、酵母、曲霉、木霉及細(xì)菌體內(nèi)。它參與生物體的糖代謝，對維持生物體正常生理功能起著重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖，參與EMP糖酵解途徑，是參與雙歧桿菌糖代謝的有關(guān)酶系之一[4]。

纖維是動物吃進(jìn)體內(nèi)的植物無法消化的部分，為不可吸收的多糖類[5-6]。同時它可促進(jìn)腸道蠕動，降低食物的滯腸時間，促進(jìn)排便，但牛等動物自身不能產(chǎn)生纖維素酶，不能很好的吸收[7-10]。而在纖維素糖化過程中，β-葡萄糖苷酶的功能是將纖維二糖和纖維寡糖水解形成葡萄糖，動物更能充分地利用葡萄糖，從而促進(jìn)動物生長。以往文獻(xiàn)報道的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株多為霉菌，如黑曲霉。但是菌株的產(chǎn)酶活性會隨著時間的增長而降低，不利于儲存。本試驗旨在篩選出高活性的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌菌株，并圍繞該菌株的產(chǎn)酶活性及酶學(xué)特性進(jìn)行考察，利用其在親核試劑間催化轉(zhuǎn)移糖苷的作用添加到飼料中，提高飼料消化率和利用率，促進(jìn)動物營養(yǎng)的消化吸收、提高動物的飼料轉(zhuǎn)化率、防病和促進(jìn)生長的作用，同時為今后開發(fā)安全、穩(wěn)定、有效的微生態(tài)制劑的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及配制

LA培養(yǎng)基：950 ml蒸餾水中加入胰蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g、搖勻溶解，定容到1 000 ml，pH值7.0。

LB培養(yǎng)基：LA培養(yǎng)基+Amp。

PDA培養(yǎng)基：稱量去皮馬鈴薯200 g，將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1.00 L，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣。將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂20.00 g，加熱熔化。加入葡萄糖20.00 g。葡萄糖溶解后，加入適宜的水量以補充加熱過程中損失的水分，定容至1.00 L（115℃蒸氣滅菌20 min），pH值7.0。

NB培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g、牛肉膏0.30 g、氯化鈉0.50 g、蒸餾水100 ml，pH值7.0。

七葉苷分離培養(yǎng)基：LA培養(yǎng)基+1.0 g七葉苷+0.50 g檸檬酸高鐵銨（115℃蒸氣滅菌20 min）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：1.0%蛋白胨，0.50%酵母膏，0.50%氯化鈉，Mandels微量元素鹽溶液（七水合硫酸亞鐵5.0 mg/l，一水合硫酸錳1.6 mg/l，七水合硫酸鋅1.4 mg/l，氯化鈷2.0 mg/l，加200.0 ml蒸餾水溶解pH值調(diào)至5.5，定容重1 000 ml），pH值自然。

以上培養(yǎng)基無特殊要求均在121℃，高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 芽孢桿菌的篩選

1.2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株平板的制作

稱取從土壤中取得樣品5.0 g于試管中并加入9.0 ml無菌水，在沸水中煮沸5 min，稀釋土樣，用移液槍分別取10-3、10-5、10-7g/ml稀釋度，于七葉苷分離培養(yǎng)基中，37℃恒溫平板倒置培養(yǎng)2～3 d。

1.2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的初篩

采用平板畫十字的方法用滅菌竹簽刮取少量菌株分別點接到依照上述方法制備的LA培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)2～3 d后觀察結(jié)果。

1.2.3 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的純化

用滅菌的竹簽挑起少量菌株劃線于依照上述方法制備的PDA斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2～3 d后觀察菌的生長情況。

1.2.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的復(fù)篩

用滅菌的竹簽挑起PDA培養(yǎng)基上的少量菌，然后接種于裝有50.0 ml發(fā)酵培養(yǎng)液的250 ml三角瓶中，37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min,所得上清液為粗酶液。

液體培養(yǎng)基，37℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)；平板培養(yǎng)，37℃恒溫平板倒置培養(yǎng)。將發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min，所得上清液為粗酶液。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及酶活性測定

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：依次吸取10 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置于試管中，補加蒸餾水至1.0 ml，再加入1.0 ml DNS試劑，充分混合后沸水浴5 min，冷卻后用蒸餾水稀釋至10 ml，在540 nm波長處測定其吸光值[11]。

吸取0.500 ml一定稀釋度的樣品溶液，加入0.500 ml 0.5%的水楊苷（溶解于0.1 mol/l pH值4.8的醋酸緩沖液中），55℃保溫20 min，再加入1.0 ml DNS試劑充分混合后沸水浴5 min，待冷卻后用蒸餾水稀釋至10 ml，在540 nm波長處測定其吸光值，以加熱滅活的酶液按照同樣方法處理作為空白。酶活定義為每小時由底物產(chǎn)生1 μmol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶活單位（U）[12-13]。

1.3 酶學(xué)特性測定

1.3.1 酶最適溫度

在35、40、45、50、55、60、65 ℃的不同溫度下按常規(guī)DNS法測酶活，確定溫度對酶活力的影響，然后在4℃和上述各溫度下各保溫1 h后，在35℃下測酶活，確定穩(wěn)定性。

1.3.2 酶最適pH值

用 pH 值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的緩沖液配制水楊苷溶液，測酶活，確定最適pH值。又以不同pH值緩沖液1.500 ml中加0.500 ml粗酶液，在最適溫度下保溫1 h后，在最適溫度下測酶活，以自然狀態(tài)下的酶活為100%。

1.3.3 反應(yīng)時間的影響

在最適溫度最適pH值下，分別測反應(yīng)時間為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min下的不同酶活。

1.3.4 金屬離子的影響

配制各種金屬離子濃度為0.020 mol/l，使其反應(yīng)終濃度為0.004 mol/l，在最適溫度下保溫1 h后測酶活，以未加金屬離子的酶活為100%。

1.3.5 有機溶劑的影響

在酶用量和底物濃度均相同的反應(yīng)體系中，添加不同的有機溶劑，使其終濃度為10%、20%、30%、40%、50%、60%，并以未添加有機溶劑為空白對照，在最適溫度最適pH值下測酶活。

1.4 16S rDNA鑒定

1.4.1 細(xì)菌DNA的制備和擴增

將篩選出的芽孢桿菌接種于NB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h。取1.5 ml培養(yǎng)液與離心管中，12 000 r/min離心30 s，棄上清液，收集菌體進(jìn)行DNA的制備和PCR擴增[14-15]。

1.4.2 擴增產(chǎn)物的電泳分析

以1倍TAE緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠。取PCR擴增產(chǎn)物5 μl，加入溴酚藍(lán)指示劑，混勻后加樣。100 V電泳30 min，溴化乙錠染色20 min，紫外燈下觀察電泳結(jié)果[16]。

1.4.3 測序及序列比對

擴增儲存鑒定細(xì)菌的16S rDNA片段，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化和測序后做Blast分析，并在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中比對，獲得鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)特征

試驗共篩選得到了15株疑似芽孢桿菌菌株，分別標(biāo)記Z-1～Z-15，通過復(fù)篩得到5株活性較高的菌株分別為Z-1、Z-3、Z-4、Z-8、Z-15，其中活性相對最高的為Z-1。因此Z-1作為目的菌株做后續(xù)研究。Z-1的單菌落為圓形，乳白色，邊緣整齊，表面有褶皺，隆起，不透明，革蘭氏染色為陽性，桿狀。

2.2 生理生化鑒定

對Z-1菌株進(jìn)行生理生化性質(zhì)測定，結(jié)果如表1所示。

經(jīng)形態(tài)學(xué)及生理生化試驗結(jié)果，參考伯杰細(xì)菌手冊[17]可將Z-1菌株初步定為芽孢桿菌屬（Bacillus app.）。

2.3 16S rDNA鑒定

分離菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測（見圖1）。由圖1可知，分離的芽孢桿菌菌株得到一條清晰的條帶，與Marker相比，所獲得的擴增片段大小在長度為1 460 bp左右，說明所得PCR產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，可以純化后進(jìn)行測序。將測得的序列與數(shù)據(jù)庫中已注冊的16S rDNA序列用BLAST程序進(jìn)行序列相似性比較分析。將Genbank中與Z-1菌株相似性較高的8個菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2和表2。

表1 Z-1菌株的生理生化鑒定

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 菌株Z-1的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

供試菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株同源相似度大部分在98%以上，初步將此菌株歸為芽孢桿菌屬，同時與標(biāo)準(zhǔn)菌株AB021198（Bacillus subtilis）的同源相似性最高，達(dá)99.49%，因此，根據(jù)16S rDNA序列相似性分析，鑒定此菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。16S rDNA序列相似度達(dá)99.49%。

表2 菌株Z-1與8種標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似性比較

2.4 酶的最適溫度及其熱穩(wěn)定性

在35～65℃下測定β-葡萄糖苷酶的活性見圖3～圖4。

圖3 溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖4 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性

在圖3中可以觀察出最適溫度為50℃附近。在熱穩(wěn)定性的測定中，如圖3可以看出,在低于55℃時酶活均在60%以上，且隨溫度升高酶的熱穩(wěn)定性下降。

2.5 酶的最適pH值及其酸堿穩(wěn)定性

在pH值為3.0～12.0間測定酶的活性，見圖5～圖6。

圖5 pH值對β-葡萄糖苷酶活性的影響

圖6 β-葡萄糖苷酶的pH值穩(wěn)定性

如圖5中，酶的最適pH值在6.0～8.0之間。如圖6當(dāng)pH值達(dá)5.0～8.0時酶的穩(wěn)定性較好均在80%以上，在堿性條件時，隨pH值升高酶活降低，表明該菌產(chǎn)的酶不耐堿性。

2.6 反應(yīng)時間對酶活性的影響

在5～55 min間測定β-葡萄糖苷酶的活性，如圖7所示。

如圖7中可知最適反應(yīng)時間為35 min附近，且在35 min后趨于穩(wěn)定。

圖7 反應(yīng)時間對β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.7 金屬離子對酶活性的影響（見表3）

表3 金屬離子對酶活的影響

不同金屬離子對酶活性的影響不同，其中有起激活劑的作用，也有起抑制劑的作用。

如表3中所示，Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+均明顯地提高酶的活性，有激活作用；Fe2+、K+都明顯的降低了酶的活性，起抑制作用。

2.8 有機溶劑對酶活性的影響

在甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯4種溶劑中，對酶活性的影響如圖8所示。

如圖8中所示，甲醇和乙酸乙酯對該酶促進(jìn)作用影響較大，丙酮抑制作用較大，而乙醇的影響不明顯。

3 討論

目前，國內(nèi)對黑曲霉中β-葡萄糖苷酶研究較多，但由于采用黑曲霉作為產(chǎn)酶菌株存在食品安全衛(wèi)生方面的隱患，所以在食品加工中的應(yīng)用受到限制?，F(xiàn)在有研究選用德氏乳桿菌亞種進(jìn)行β-葡萄糖苷酶的分離和純化[18]，并應(yīng)用于大豆異黃酮的水解過程中，制備大豆異黃酮苷元。但是德氏乳桿菌以產(chǎn)乳酸為主，產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性較低。本試驗從土壤中篩選出1株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株，進(jìn)行16S rDNA鑒定，經(jīng)過同源性比較分析確定為枯草芽孢桿菌，同源性達(dá)到99.49%。

圖8 有機溶劑對β-葡萄糖苷酶活性的影響

對菌株Z-1進(jìn)行酶學(xué)特性研究表明，Z-1菌株的最適溫度在50℃附近，55℃以下時酶活均在60%以上；最適pH值在6～8之間；最佳反應(yīng)時間在35 min附近；金屬離子Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+有激活作用，而離子Fe2+、K+起抑制作用；有機溶劑甲醇和乙酸乙酯對該酶促進(jìn)作用影響較大，丙酮抑制作用較大，而乙醇的影響不明顯。本試驗篩選出的Z-1菌株為1株芽孢桿菌，利用芽孢桿菌的抗逆性為以后的生產(chǎn)、保存奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗通過初篩復(fù)篩得到了1株活性較高的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌菌株。經(jīng)16S rDNA序列同源性進(jìn)行比較分析，最終鑒定為枯草芽孢桿菌，為β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用和開發(fā)提供更廣闊的空間。