■周 凱 徐 慧 劉建軍，

（1.齊魯工業(yè)大學輕工學部，山東濟南250353；2.山東省食品發(fā)酵工程重點實驗室，山東濟南250013）

白酒酒糟是白酒發(fā)酵的主要廢棄物。酒糟中含有大量氨基酸、脂肪及多種微量元素等營養(yǎng)[1]成分，可以代替主糧添加進飼料[2-5]，達到緩解人畜爭糧矛盾[6]的目的。酒糟添加進飼料可以降低飼料成本[7]、提高酒廠利潤。但添加酒糟的飼料含有大量的木聚糖、甘露聚糖、大分子蛋白質、植酸以及退化淀粉等抗營養(yǎng)因子。為降解這些抗營養(yǎng)因子，大量產消化酶益生菌[8]被運用于飼料生產中，多酶益生菌飼料[9]應運而生。多酶益生菌飼料是采用微生物發(fā)酵的方法對飼料底料進行發(fā)酵生產的營養(yǎng)價值高、易被消化吸收、富含多種消化酶且兼具有一定的益生特性[10]的飼料。在多酶益生菌飼料制備過程中，菌種的選擇至關重要。利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵生產的飼料具有富含多種消化酶、安全無毒等特性[11-12]。飼料中添加乳酸菌（Lacticacid bacteria）則可以改善飼料風味，提高飼料適口性[13]。除此之外，枯草芽孢桿菌與乳酸菌互利共生，共同培養(yǎng)可以有效抑制大腸桿菌等好氧致病菌的生長繁殖[14]。因此，目前大多數多酶益生菌飼料均采用枯草芽孢桿菌和乳酸菌作為發(fā)酵菌種。

試驗選擇實驗室保藏的產木聚糖酶、甘露聚糖酶、植酸酶、蛋白酶、淀粉酶的枯草芽孢桿菌和乳酸片球菌對添加白酒酒糟的飼料底料進行發(fā)酵，制備多酶益生菌飼料。以產酶菌種的活菌數與酶活在一定范圍內呈正相關[15]為理論依據，考察多酶益生菌飼料中底物的各組分比例及發(fā)酵條件對益生菌活菌數的影響。通過單因素和正交試驗探究制備多酶益生菌飼料的工藝，為多酶益生菌飼料的規(guī)模化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

試驗選擇產甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌L-1、產植酸酶的枯草芽孢桿菌L-2、產木聚糖酶的枯草芽孢桿菌YB-5，改善飼料風味的乳酸片球菌Rp。以上菌種均由實驗室保藏并提供。

1.1.2 原料

白酒酒糟、玉米粉、麩皮、豆粕。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

①乳酸片球菌種子培養(yǎng)基(g/l)：牛肉膏 10、蛋白胨10、酵母粉5、葡萄糖5、醋酸鈉5、檸檬酸二銨2、吐溫80 1，pH值6.5～6.8，37 ℃靜置培養(yǎng)6 h接種。

②枯草芽孢桿菌種子培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、牛肉膏5、氯化鈉3，pH值7.0，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)5 h后接種。

③ 平板計數培養(yǎng)基（g/l）：蛋白胨10、牛肉膏5、酵母粉5、葡萄糖5、醋酸鈉5、檸檬酸二銨2、吐溫80 1、瓊脂條20，pH值6.5，涂布后培養(yǎng)24 h計數。

④ 初始固態(tài)培養(yǎng)基：酒糟400 g、玉米粉250 g、麩皮200 g、豆粕150 g，初始pH值7.0，37 ℃培養(yǎng)72 h，測定酶活及活菌數。

以上培養(yǎng)基均在溫度121℃、時間20 min條件下滅菌。

1.3 試驗方法

活化益生菌種產甘露聚糖酶的枯草芽孢桿菌L-1、產植酸酶的枯草芽孢桿菌L-2、產木聚糖酶的枯草芽孢桿菌YB-5、乳酸片球菌Rp。接種順序為L-2先接種4 h，再同時接L-1、YB-5、Rp；L-1、L-2、YB-5、Rp接種比例為1∶1∶2∶4；接種量為15%，37℃下培養(yǎng)84 h，發(fā)酵結束后取樣檢測指標。

1.4 檢測方法

1.4.1 多酶益生菌飼料活菌數測定（平板計數）

取發(fā)酵結束后的多酶益生菌飼料1 g，置于100 ml蒸餾水中，加入玻璃珠振蕩搖勻30 min。進行10-1～10-11梯度稀釋，搖勻后以0.2 ml稀釋液涂布計數。選擇菌落個數在10～300以內的平板計數，數據以同梯度三個平板菌落平均數為準。

1.4.2 酶活測定

固體樣品測定時取發(fā)酵結束后的多酶益生菌飼料5 g，稀釋到50 ml加玻璃珠振蕩30 min。4 000 r/min離心20 min，以上清液為粗酶液。以不同的方法測定飼料樣品中的酶活[16]。

液體樣品以4 000 r/min轉速離心20 min后取上清液為粗酶液。

測定甘露聚糖酶酶活采用DNS法[17]；植酸酶酶活測定采用鉬黃法[18-19]；木聚糖酶活測定采用DNS法[20]；蛋白酶酶活測定采用考馬斯亮藍法[21]；淀粉酶酶活測定采用DNS法[22]。

2 結果與分析

2.1 底料組分對多酶益生菌飼料中益生菌活菌數的影響

2.1.1 白酒酒糟含量對活菌數的影響(見圖1)

圖1 白酒酒糟含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

白酒酒糟可以豐富多酶益生菌飼料底料中的蛋白種類。除此之外還可以降低底料中的黏性，利于好氧益生菌的生長繁殖。分別取占發(fā)酵干基底料8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、52%質量分數的白酒酒糟進行試驗，發(fā)酵結束后取樣測定多酶益生菌飼料中的益生菌活菌數。圖1表明，白酒酒糟含量在35%～45%之間，活菌數最多。

2.1.2 玉米粉含量對活菌數的影響(見圖2)

圖2 玉米粉含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

試驗中考察玉米粉含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響。如圖2所示，玉米粉占發(fā)酵干基底料質量分數在20%～30%時菌體活菌數均維持在一個較高的水平。

2.1.3 麩皮含量對活菌數的影響(見圖3)

圖3 麩皮含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

試驗中麩皮含量對活菌數影響較大。如圖3所示，干基底料中麩皮含量在20%～30%（m/m）之間時活菌數達到最大值。

2.1.4 豆粕含量對活菌數的影響(見圖4)

圖4 豆粕含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

豆粕在飼料中添加可以豐富飼料中蛋白種類，飼料中豆粕含量的改變會引起活菌數的變化。如圖4所示，干基底料中豆粕含量在7%～9%（m/m）范圍內活菌數含量最高。

2.1.5 料水比對活菌數的影響(見圖5)

圖5 料水比對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

多酶益生菌飼料發(fā)酵中水活度對活菌數影響較大，當飼料中含水量較低時菌體生長繁殖受到抑制，活菌數含量較低。水分含量較高時，飼料黏性升高，降低溶氧量，導致活菌數較低，圖5表明，料水比為1∶0.8時活菌數取得最大值。

2.1.6 硫酸銨含量對活菌數的影響(見圖6)

圖6 硫酸銨含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

試驗選擇硫酸銨溶入水中作為多酶益生菌發(fā)酵中的無機氮源，豐富氮源種類，提高益生菌活菌數含量。圖6表明，在水中溶解質量分數為2.0%硫酸銨時活菌數含量達到最大值。

2.1.7 尿素含量對活菌數的影響(見圖7)

圖7 尿素含量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

尿素作為無機氮源硫酸銨的補充添加進飼料當中，圖7反映出當尿素質量占水分質量的1.1%時，活菌數維持在較高水平。

2.1.8 多酶益生菌飼料組分含量的正交試驗

在單因素試驗的基礎上選擇發(fā)酵過程中對活菌數對應含量最高的麩皮、料水比、酒糟、豆粕、尿素為因素，設計5因素4水平設計正交試驗表（見表1）考察多酶益生菌飼料中活菌數，最終確定多酶益生菌飼料中各組分含量。

2.1.9 正交試驗結果

根據正交表L16(45)進行試驗，試驗結果見表2。

對表2進行極差分析可以看出，組合A3B2C1D4E3為優(yōu)勢組合。試驗無此組合，故選擇活菌數最大的A2B2C1D4E3為優(yōu)勢組合，即麩皮含量在28%，料水比為1∶0.8酒糟含量36%，豆粕含量8%，尿素值為1.1%。因四種固態(tài)底料成分之和為100%，故確定玉米粉質量分數為26%，此時活菌數到達最大值1.8×1011cfu/g。隨后對試驗結果進行方差分析（如表3所示）。其中，因素A麩皮含量和因素B底料含水量對多酶益生菌飼料發(fā)酵中益生菌活菌數影響最大。

表1 正交因素水平設計

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

2.2 發(fā)酵條件對多酶益生菌飼料中益生菌活菌數的影響

在確定多酶益生菌飼料的底料組分后，繼續(xù)試驗考察發(fā)酵時間、溫度、初始pH值以及固料裝填量對益生菌活菌數的影響，確定發(fā)酵條件。

2.2.1 發(fā)酵時間對活菌數的影響（見圖8）

圖8 發(fā)酵時間對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

在固態(tài)發(fā)酵過程中，隨著時間的增加，多酶益生菌飼料中活菌數逐漸增加，但是隨著時間的推移，多酶益生菌飼料中益生菌數逐漸達到臨界，在此之后活菌數不再增加。如圖8所示，發(fā)酵進行到在84 h時活菌數達到最大值。

2.2.2 發(fā)酵溫度對活菌數的影響（見圖9）

圖9 發(fā)酵溫度對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

試驗過程考察多酶益生菌飼料在不同培養(yǎng)溫度下的活菌數變化趨勢，圖9表明，當溫度在35～37℃范圍時，活菌數達到最大值。

2.2.3 初始pH值對活菌數的影響（見圖10）

圖10 初始pH值對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

調節(jié)多酶益生菌飼料培養(yǎng)基中的初始pH值，發(fā)現初始pH值在6.5～7.5范圍內對活菌數影響不大，參考圖10數據取初始pH值7.0作為發(fā)酵pH值。

2.2.4 裝填量對活菌數的影響（見圖11）

圖11 搖瓶裝填量對多酶益生菌飼料中活菌數的影響

如圖11所示，在250 ml搖瓶中分別裝填14、16、18、20、22 g固態(tài)發(fā)酵底料，檢測發(fā)酵結束后益生菌活菌體的數量。發(fā)現搖瓶裝填量在20 g/250 ml時，活菌數最大。

2.3 驗證試驗

在單因素結束后，確定最佳發(fā)酵條件為：初始pH值7.0、溫度37℃、裝填量20 g/250 ml條件下發(fā)酵84 h。在此條件下進行驗證試驗，結果如表4所示。

表4 驗證試驗結果

3 討論與小結

通過單因素及正交試驗得到多酶益生菌飼料發(fā)酵生產的最優(yōu)條件為，干基中麩皮含量為28%、白酒酒糟含量36%、玉米粉含量26%、豆粕含量8%；料水比為1∶0.8，水中含有2.0%硫酸銨和1.1%尿素。在初始pH值為7.0、溫度為37℃、裝填量為20 g/250 ml條件下發(fā)酵84 h。測得該多酶益生菌飼料中益生菌活菌數為1.97×1011cfu/g、木聚糖酶酶活達到15.30 U/g、植酸酶酶活16.37 U/g、甘露聚糖酶酶活11.62 U/g、淀粉酶酶活19.37 U/g、蛋白酶酶活15.27 U/g。在最優(yōu)條件下，多酶益生菌飼料各指標均有較大幅度的提高，其中麩皮含量與料水比在試驗中對多酶益生菌飼料的活菌數影響最大。在生產多酶益生菌飼料的同時，充分利用了白酒酒糟當中的營養(yǎng)成分，為白酒酒糟的高附加值利用提供了可行的途徑。