■王 全 王 會李紅亞李術(shù)娜

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071001；2.衡水市農(nóng)機管理總站,河北衡水053000）

木質(zhì)素是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的一種天然有機高分子化合物。它廣泛存在于高等植物細(xì)胞壁中，是含量僅次于纖維素的生物多聚體。由于分子大（相對分子質(zhì)量＞1.0×105），溶解性差，沒有任何規(guī)則的重復(fù)單元或易被水解的鍵，所以木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜而不規(guī)則；由于含有各種生物學(xué)穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型，因而微生物及其分泌的胞外酶不易與之結(jié)合，是目前公認(rèn)的微生物難降解的芳香族化合物之一。盡管許多微生物能分解單獨存在的纖維素，但由于在細(xì)胞壁中纖維素受到木質(zhì)素的保護，而木質(zhì)素有完整堅硬的外殼，不易被微生物降解，因此，纖維素的分解受到限制。

目前，影響牲畜對植物纖維素高效利用的關(guān)鍵問題之一是木質(zhì)素的阻礙作用。秸稈主要成分為木質(zhì)素，難以被禽畜直接消化利用，利用微生物將木質(zhì)素降解為單糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，可大大增加秸稈的消化率。國外科學(xué)家對一些降解木質(zhì)素能力強并具有較強選擇性的菌種進行了較為深入的研究，有的菌種或其產(chǎn)生的高效木質(zhì)素降解酶已經(jīng)被應(yīng)用到某些工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

我國在此方面的研究起步較晚，具有較強降解木質(zhì)素能力并有較好工農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景的菌種也較匱乏，傳統(tǒng)的秸稈飼料發(fā)酵劑中降解木質(zhì)素的菌株為白腐菌、褐腐菌、軟腐菌、黃孢原毛平革菌、變色栓菌等[1-4]，多為真菌類，普遍存在大規(guī)模生產(chǎn)工藝復(fù)雜，菌劑穩(wěn)定性低，活性不易保存等一系列缺點。雖然細(xì)菌對木質(zhì)素的降解作用遠(yuǎn)小于真菌。但是并不能說細(xì)菌在木質(zhì)素生物降解研究中地位就不重要。細(xì)菌的繁殖速度遠(yuǎn)高于真菌，在初級代謝階段即可降解木質(zhì)素，使木質(zhì)纖維物質(zhì)發(fā)生改性，以利于后續(xù)菌株的有效降解[5-12]。

本研究中采用水解圈結(jié)合定量測定酶活的方法，從自然界特殊環(huán)境中篩選高效降解木質(zhì)素的產(chǎn)芽孢細(xì)菌，并對其種屬進行鑒定，利用定性測定方法對這幾株菌種的木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生能力和活力進行了比較，篩選出1株較優(yōu)菌種，最后摸索其產(chǎn)芽孢條件。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米秸稈

所用秸稈品種為農(nóng)大3138(CAU 3138)，秸稈切割成1 mm和1～2 cm的小段便于后期分析。1 mm的玉米秸稈發(fā)酵后用苯-乙醇提取后分析。

1.1.2 菌株來源

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖場新鮮牛糞便。

1.1.3 化學(xué)試劑

木質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma化學(xué)試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級試劑；0.4%放線菌酮溶液。

1.1.4 培養(yǎng)基

基本培養(yǎng)基（BM）、苯胺藍(lán)培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、NB培養(yǎng)基、復(fù)篩液體發(fā)酵培養(yǎng)基、產(chǎn)芽孢基礎(chǔ)培養(yǎng)基、菌種鑒定培養(yǎng)基、甲基紅（M.R）試驗培養(yǎng)基、V-P試驗培養(yǎng)基、淀粉水解培養(yǎng)基、硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基、亞硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基、產(chǎn)氨試驗培養(yǎng)基、脲酶培養(yǎng)基、吲哚試驗培養(yǎng)基、苯丙氨基酸脫氨酶培養(yǎng)基、明膠液化試驗培養(yǎng)基、脂酶（Tween-80）試驗培養(yǎng)基見《微生物學(xué)試驗》[13]。生理生化鑒定培養(yǎng)基及試劑見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]。

1.2 試驗方法

1.2.1 降解木質(zhì)素芽孢桿菌的富集培養(yǎng)和初篩

芽孢菌富集：取所采糞便樣品1.0 g內(nèi)含物置于含放線菌酮母液的BM培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)20 h后，取1.0 ml發(fā)酵液裝于9.0 ml無菌水的試管中，經(jīng)90℃加熱處理15 min?；靹蛉?.0 ml進行梯度稀釋，得到一系列不同濃度的稀釋液。分別取10-4、10-5、10-6濃度梯度的稀釋液0.1 ml涂布到BM培養(yǎng)基平板上，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到BM培養(yǎng)基斜面上，編號，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

初篩(苯胺藍(lán)平板脫色法)：在BM培養(yǎng)基中加入0.01 g/100 ml的苯胺藍(lán)(Azure B)和 1.8 g/100 ml的瓊脂，滅菌后鋪平板，培養(yǎng)基上以畫十字法接種待測菌，37℃避光培養(yǎng)5 d，每天觀察記錄，以藍(lán)色培養(yǎng)基中菌落的脫色圈的有無及產(chǎn)生快慢和脫色圈的大小來定性檢測木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）和（或）錳過氧化物酶（MnP）的產(chǎn)生情況。試驗均設(shè)計3次重復(fù)，初篩所得菌株斜面置于4℃下保存。

1.2.2 菌株復(fù)篩

采用管碟法將初篩所得菌株在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，考察發(fā)酵代謝產(chǎn)物的降解活性。一方面按初篩方法考察發(fā)酵上清液的產(chǎn)酶能力；一方面定量測定發(fā)酵上清液酶活。

將初篩得到的菌株擴培，轉(zhuǎn)接到NB培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)24 h以活化菌株。將活化后的菌株接種至復(fù)篩液體發(fā)酵培養(yǎng)液中，37℃靜置培養(yǎng)48 h后，以10 000 r/min、4℃離心5 min，取上清液點樣于苯胺藍(lán)平板的微孔，每孔點樣100 μl。37℃避光培養(yǎng)5 d后觀察并記錄脫色圈的有無及大小。

1.2.3 菌株酶活力測定

木質(zhì)素降解菌的酶活力考察一般通過木質(zhì)素過氧化酶和錳過氧化酶活性來測定。

木質(zhì)素過氧化物酶活力測定(以Lip在H2O2存在下氧化Azure B染料來表示Lip活力的方法)：125 mmol/l的酒石酸鈉緩沖液（pH值3.0）1.0 ml，0.160 mmol/l的Azure B溶液500 μl，培養(yǎng)液上清500 μl，30 ℃下加入2 mmol/l的H2O2溶液 500 μl啟動反應(yīng)，測反應(yīng)最初3 min內(nèi)651 nm處OD值減少速率，1個酶活力單位以每分鐘每毫升的培養(yǎng)基濾出液降低0.1個OD值表示。

錳過氧化物酶（MnP）活力測定：50 mmol/l的乳酸鈉緩沖液（pH值4.5）3.4 ml，1.6 mmol/l的MnSO4溶液0.1 ml，0.4 ml的培養(yǎng)液上清，預(yù)熱至37℃加入1.6 mmol/l的H2O2溶液0.1 ml啟動反應(yīng)，測定反應(yīng)最初3 min內(nèi)λ=240 nm處吸光度變化，1個酶活力單位為每分鐘吸光值增加0.1的酶量。

木質(zhì)纖維素含量的測定：采用72%硫酸法測定木質(zhì)素含量；硝酸-乙醇法測定纖維素含量；蒽酮比色法測定半纖維素含量。

式中：A——纖維素（半纖維素或木質(zhì)素）的降解總量；

B——原樣品中纖維素（半纖維素或木質(zhì)素）的總量；

a——纖維素（半維素或木質(zhì)素）的降解率；

C——總纖維素的降解率。

1.2.4 菌種對秸稈木質(zhì)素降解能力的測定

每300 ml三角瓶中準(zhǔn)確稱取玉米秸稈粉20 g（20～40目），加入一定量的葡萄糖和硫酸銨，60 ml蒸餾水，即得固態(tài)培養(yǎng)基，121℃滅菌30 min。接種所篩菌株到秸稈固體培養(yǎng)基中，接種量為1.0×106個/ml，34℃靜止培養(yǎng)，每隔5 d從固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中取樣，過濾澄清，定容后進行酶活力測定，將剩余固態(tài)基質(zhì)105℃烘干至恒重，測定木質(zhì)纖維素含量。

大規(guī)模堆積培養(yǎng)模擬試驗：稱取粗粉碎后的秸稈粉200 g，用蒸汽滅菌15 min后，放入3 000 ml大三角瓶中，冷卻至常溫后，接入50 ml NB種子液。攪拌均勻后放入培養(yǎng)箱中，以堆積狀態(tài)（厚度30 cm）進行培養(yǎng)。堆積放置過程中，為防止秸稈因發(fā)酵生熱、溫度升高，應(yīng)注意控制溫度27～32℃。

1.2.5 產(chǎn)芽孢木質(zhì)素降解菌株的種屬鑒定

根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀，有關(guān)生理生化鑒別試驗，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[15]進行屬和種的鑒定。

1.2.5.1 菌種形態(tài)鑒定

菌株體形態(tài)觀察：將復(fù)篩得到的菌株進行10倍梯度稀釋，取10-4、10-5梯度的稀釋液涂NA平板，37℃培養(yǎng)24 h得單菌落，觀察記錄菌落形狀和大小、邊緣、表面、隆起形狀，透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等。另挑取斜面上37℃培養(yǎng)24 h的各個菌株，參照東秀珠等[14]的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》上的方法進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。并進行芽孢染色、鞭毛染色及異染粒觀察等。

1.2.5.2 生理生化鑒定

參照東秀珠等[14]的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行生理生化試驗。主要進行H2S產(chǎn)生試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、過氧化氫酶（接觸酶）試驗、氨基酸脫羧酶試驗、淀粉水解、V-P（乙酰甲基甲醇）試驗、M.R（甲基紅，Methyl Red）試驗、檸檬酸鹽利用、石蕊牛奶分解、糖、醇發(fā)酵、苯丙氨酸脫氨酶、產(chǎn)氨試驗、脲酶（尿素水解）試驗、亞硝酸鹽還原試驗、硝酸鹽還原試驗和熒光色素試驗[16]。

1.2.5.3 DNA提取和16S rDNA基因擴增

參考Kim等和Rainey等的方法提取細(xì)菌總DNA[17-18]。1%瓊脂糖電泳檢測。

引物為通用引物[10]，正向引物為 27F：5’-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物為1495R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

PCR反應(yīng)體系：DNA（70 ng/μl）模板2 μl；dNTP Mixture（2.5 mmol/l）2.5 μl；27F（20 μmol/l）1.5 μl；1495R（20 μmol/l）1.5 μl；10×ExTaq Buffer（Mg2+pluse）5 μl；ExTaq DNA聚合酶 0.2 μl；補足ddH2O到50 μl。

PCR條件為：94℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性1 min、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.5.4 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

將所測得的16S rDNA序列用BLAST軟件與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫進行相似性分析，并與GenBank中的相近序列在Clustal X（1.8）程序包中進行多重序列匹配排列（Multiple alignments）分析，最后形成一個多重序列匹配排列陣，其中形成的缺口用橫杠“-”填補，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解木質(zhì)素菌的初篩(見表1及圖1)

表1 初篩結(jié)果

本試驗共篩選到具有脫色圈的菌株14株，分別命名為LG-1、LG-2、LG-3、LG-4、LG-5、LG-6、LG-7、LG-8、LG-9、LG-10、LG-11、LG-12、LG-13、LG-14。

由表1可知，篩選出的木質(zhì)素降解菌LG-1脫色圈最大（見圖1），降解木質(zhì)素的效果最好。

圖1 木質(zhì)素降解菌LG-1脫色圈

2.2 復(fù)篩結(jié)果

對初篩菌株中脫色圈圈直徑較大的5個菌株LG-1、LG-7、LG-6、LG-11和LG-9進行液體發(fā)酵，測定脫色圈大小，結(jié)果見表2。

表2 復(fù)篩結(jié)果

由表2可知，菌株LG-1脫色圈直徑最大，與初篩的結(jié)果一致，肯定了LG-1的降解活性，后續(xù)試驗將LG-1確定為目的菌株。

2.3 菌株LG-1菌種鑒定結(jié)果

2.3.1 LG-1菌株形態(tài)及生理生化特征

菌落特征：根據(jù)NA培養(yǎng)基上生長的菌株LG-1的菌落形態(tài)，初步判斷其為細(xì)菌菌落，培養(yǎng)24 h的菌落為不透明的淺黃色，呈近圓形，邊緣不整齊，表面無皺摺，中間有突起(見圖2)。

圖2 菌株LG-1的菌落形態(tài)

菌體形態(tài)特征：供試菌株LG-1經(jīng)染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，菌體長約2.9 μm，寬約0.8 μm，芽孢呈橢圓形中生，長約1.8 μm，寬約0.8 μm(見圖3)。

生理生化試驗結(jié)果見表3。

將菌株LG-1形態(tài)及生理生化特征與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)屬、種進行對照，其與芽孢桿菌屬的典型特征基本一致，初步鑒定菌株LG-1屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）。

2.3.2 16S rDNA序列分析

圖3 菌株LG-1的菌體形態(tài)

表3 菌株LG-1的生理生化特征

將菌株LG-1的16S rDNA序列與GenBank中所有已測定的原核生物16S rDNA序列進行比較，得到該菌株及相關(guān)菌株的進化距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見表4和圖4。

表4 菌株LG-1與參比菌株的16S rDNA序列相似性

由表4和圖4可知，與菌株LG-1的16S rDNA序列同源相似性最高的9株標(biāo)準(zhǔn)菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中有8株與菌株LG-1的16S rDNA序列相應(yīng)的同源相似度高于90%，僅巨大芽孢桿菌與菌株LG-1序列的同源相似度較低，達(dá)到80%以上，因此可初步判斷菌株LG-1屬于芽孢桿菌屬。同時，由于供試菌株LG-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 6633的16S rDNA序列的同源相似性最高，達(dá)99.86%；另外，其形態(tài)特征及生理生化特性也與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相應(yīng)的典型特征基本一致，因此，綜合以上試驗結(jié)果，鑒定菌株LG-1為一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 菌株LG-1及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 酶活測定

2.4.1 木質(zhì)素過氧化酶活力測定

枯草芽孢桿菌LG-1菌株在發(fā)酵36 h后測定其木質(zhì)素過氧化酶的酶活力結(jié)果，并與其它菌株的酶活力進行比較（見表5）。

表5 發(fā)酵36 h后木質(zhì)素過氧化酶酶活力

由表5可以看出，發(fā)酵36 h時，菌株LG-1酶活力雖然不是最高的，但已經(jīng)和最高的LG-9很接近。同時也可以看出，菌株LG-1的酶活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它菌株。

枯草芽孢桿菌LG-1菌株在發(fā)酵60 h后測定其木質(zhì)素過氧化酶的酶活力結(jié)果，并與其它菌株的酶活力進行比較（見表6）。

表6 發(fā)酵60 h后木質(zhì)素過氧化酶酶活力

由表6可以看出，發(fā)酵60 h時，菌株LG-1酶活力是最高的，是LG-7的2.15倍，LG-6菌株的3.35倍，LG-11菌株的3.72倍。

2.4.2 錳過氧化物酶（MnP）活力測定

枯草芽孢桿菌LG-1菌株在發(fā)酵60 h后測定其錳過氧化酶的酶活力結(jié)果，并與其它菌株的酶活力進行比較（見表7）。

表7 發(fā)酵60 h后錳過氧化酶酶活力

由表7可知，LG-1菌株在發(fā)酵60 h后的MnP酶活力達(dá)到610.8 U/l。

2.5 木質(zhì)素降解能力測定

將枯草芽孢桿菌LG-1接種到玉米秸稈粉中，在不同的時間測定其對秸稈的降解率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌株降解率與發(fā)酵時間示意圖

由圖5可以看出，枯草芽孢桿菌LG-1對玉米秸稈中的木質(zhì)素有顯著的降解能力。隨著發(fā)酵時間的延長，木質(zhì)素的降解率逐漸增加，在21 d后降解率達(dá)到最高水平23.9%，但未接種組的木質(zhì)素降解率只有4.9%。從木質(zhì)素降解率的變化趨勢來看，在發(fā)酵16 d時就已經(jīng)達(dá)到23.6%，在后面5 d中變化不大。原因是由于孢子液直接接種到玉米秸稈粉中，從孢子萌發(fā)到產(chǎn)生代謝酶需要一定時間，所以在發(fā)酵的初始階段酶的活性較低，木質(zhì)素降解率較低。隨著菌株的生長，酶的產(chǎn)生量達(dá)到最高水平，木質(zhì)素的降解率同時也達(dá)到最高水平。在發(fā)酵16 d時，酶的產(chǎn)生量達(dá)到最高水平，從16～21 d，酶的產(chǎn)生量變化不大，因此木質(zhì)素的降解率變化也不大。

3 討論

產(chǎn)芽孢細(xì)菌在不良環(huán)境下可形成休眠體芽孢，可以耐受惡劣環(huán)境。在工業(yè)化生產(chǎn)中可制成芽孢菌粉，有生物量高、存活時間長的特點，在降解木質(zhì)素的應(yīng)用效果中，能持續(xù)發(fā)揮降解作用。本研究分離篩選到能高效降解木質(zhì)素的枯草芽孢桿菌LG-1，為木質(zhì)素降解提供可供工業(yè)化生產(chǎn)及大規(guī)模應(yīng)用的優(yōu)良菌種。

堆積發(fā)酵試驗表明，在未進行發(fā)酵條件優(yōu)化的情況下，LG-1菌株對秸稈木質(zhì)素表現(xiàn)出強降解作用。LG-1菌株發(fā)酵玉米秸稈16 d后，木質(zhì)素降解率可達(dá)23.6%。相較于燕紅等[20]報道的地衣芽孢桿菌對麥麩木質(zhì)素的降解率17.3%、蠟樣芽孢桿菌對稻草木質(zhì)素降解率2.81%，丁志剛等[21]報道的地衣芽孢桿菌對麥秸和稻草木質(zhì)素2.2%和3.9%的降解率而言，LG-1菌株降解木質(zhì)素的能力更有效。LG-1菌株對木質(zhì)素的強降解作用依賴于LiP及MnP的產(chǎn)生，對于有無其他關(guān)鍵酶系尚需進一步研究確定。

木質(zhì)素是人類可再生的纖維資源之一，使木質(zhì)素轉(zhuǎn)變?yōu)橛杏玫奈镔|(zhì)，變廢為寶，這將對我國的造紙工業(yè)、環(huán)境保護以及可持續(xù)發(fā)展等均具有深遠(yuǎn)的意義。木質(zhì)素的生物降解在許多應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊的前景，但由于一些基礎(chǔ)研究如木質(zhì)素的空間結(jié)構(gòu)、每種木質(zhì)素酶的作用機理以及木質(zhì)素酶基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控等尚未完全研究清楚，所以，離實際應(yīng)用還有一段距離。正因如此，木質(zhì)素的生物降解也一直是世界性研究熱點和難題。相信在不久的將來，隨著蛋白質(zhì)分離、純化、空間構(gòu)象測定技術(shù)的發(fā)展，隨著對木質(zhì)素酶催化機理認(rèn)識的加深，以及應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對木質(zhì)素降解酶相關(guān)基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機理等深入研究，這些問題將會逐一解決。

4 結(jié)論

木質(zhì)素降解菌枯草芽孢桿菌LG-1菌株可以產(chǎn)生MnP及LiP等木質(zhì)素降解酶，并可高效降解玉米秸稈木質(zhì)素，為工業(yè)化生產(chǎn)提供優(yōu)良菌種。