白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔的解熱作用及其機(jī)制研究

楊斌，徐向東*

(山東省中醫(yī)院，濟(jì)南 250011)

摘要：目的探討白虎湯對(duì)內(nèi)毒素發(fā)熱家兔的解熱作用及其機(jī)制。方法將32只新西蘭大白兔隨機(jī)分為正常組、模型組、白虎湯低、高劑量組(10,20 g/kg)，造模前，空白、模型2組分別灌胃等量生理鹽水，白虎湯低、高劑量組分別灌胃不同劑量藥物,1次/d，連續(xù)5 d。第6天，除正常組外，其余3組分別通過耳緣靜脈注入大腸桿菌內(nèi)毒素方法復(fù)制發(fā)熱家兔模型，觀察各組動(dòng)物癥狀及體溫變化；采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α水平；采用流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+水平。結(jié)果與正常組相比,模型組家兔體溫,TNF-α、IL-1β、IL-6、ET和CD8+水平顯著上升(P<0.01),CD4+水平與CD4+/CD8+顯著下降(P<0.01)；與模型組相比，白虎湯高、低劑量組家兔體溫、TNF-α、IL-1β、IL-6、 ET、CD8+水平明顯下降(P<0.05或P<0.01),CD4+水平與CD4+/CD8+顯著上升(P<0.05或P<0.01)。白虎湯高、低劑量均對(duì)內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔有顯著的解熱效應(yīng)(P<0.05或P<0.01)，均可明顯抑制發(fā)熱家兔TNF-α、IL-1β、IL-6、ET、CD8+水平升高(P<0.05或P<0.01)，促進(jìn)CD4+水平與CD4+/CD8+顯著上升(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論白虎湯對(duì)內(nèi)毒素性發(fā)熱家兔有解熱的作用，機(jī)制可能是通過抑制發(fā)熱家兔致熱性細(xì)胞因子的釋放，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而發(fā)揮其解熱的作用。

關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素；發(fā)熱；白虎湯；家兔

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.05.023

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)05-0508-04

基金項(xiàng)目:山東省自然科學(xué)基金(Y2006C113)。

作者簡(jiǎn)介:楊斌(1971-)，男，主管藥師，主要從事中藥新藥開發(fā)及中藥炮制原理的研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-10-20)

*通信作者:徐向東，電話-13793188391，電子信箱-zhengsanxiasd@126.com

Antipyretic effect and mechanism of action of Baihu decoction for fever rabbits caused by endotoxin

YANG Bin,XU Xiangdong*

(Affiliated Hospital to Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Ji’nan 250011,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the antipyretic effect and mechanism of Baihu decoction for fever rabbits caused by endotoxin.MethodsThe 32 New Zealand rabbits were randomly divided into normal group,model group,Baihu decoction low-dose group,high-dose group (10,20 g/kg).Before modeling,blank group and model group,two groups were given amount of normal saline respectively,Baihu decoction low-dose group,high-dose group were given doses of drugs respectively,once a day,and lasted five days,The sixth day,except the normal group,the other 3 groups were injected through ear vein Escherichia Coli Endotoxin replication fever in rabbits model,to observe the change of symptoms and body temperature of each animal;Using double antibody sandwich EllSA method to test the levels of serum IL-1β,IL-6,tumor necrosis factor TNF-a.Using flow cytometry to test the levels of Tlymphocyte subsets and CD4+,CD8+.ResultsCompared with normal group,the model group significantly increased body temperature in rabbits,TNF-α,IL-1β,IL-6 and CD8+ levels(P<0.01),CD4+ level and CD4+/CD8+ decreased significantly(P<0.01);Compared with the model group,Baihu decoction high dose group significantly decreased in low dose group rabbits body temperature,TNF-α,IL-1β,IL-6 the level of CD8+(P<0.05,P<0.01),increased CD4+ levels and CD4+/CD8+ (P<0.05 or P<0.01).Baihu tang Low-dose group,high dose group both had antipyretic effect significantly for fever rabbits caused by endotoxin(P<0.05 or P<0.01),can inhibit the fever in rabbits TNF-α,IL-1β,IL-6,CD8+ levels (P<0.05 or P<0.01),promote the significant increase of the CD4+ level and CD4+/CD8+(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe Baihu decoction has antipyretic effect on rabbits with endotoxin fever,mechanism may be the inhibition on fever in rabbits induced heat release of cytokines,regulate immune function and its antipyretic role.

Keywords:endotoxin;fever;Baihu decoction;rabbit

白虎湯出自《傷寒論》，主治傷寒陽(yáng)明熱盛證，或溫病氣分熱盛證，后世醫(yī)家沿用不衰，現(xiàn)代臨床更有廣泛應(yīng)用。尤其在急性傳染性疾病和急性感染性疾病的治療方面，有很好的療效。對(duì)于溫病高熱癥，包括肺炎高熱，腮腺炎高熱，腎盂腎炎高熱，急性化膿性扁桃體炎高熱，施以白虎湯加減治療效果明顯。本實(shí)驗(yàn)在成功復(fù)制發(fā)熱家兔模型基礎(chǔ)上，觀察內(nèi)毒素致熱家兔模型的作用及機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物白虎湯藥物組成:石膏一斤(50 g)碎，知母六兩(18 g)，炙甘草二兩(6 g)，粳米六合(9 g)。所有中藥購(gòu)自山東省中醫(yī)院,并經(jīng)本院國(guó)家中藥三級(jí)實(shí)驗(yàn)室張學(xué)順主任藥師鑒定。中藥制備方法：石膏先煎20 min，繼之將知母、粳米、甘草放入藥液中浸泡15 min，以武火煮沸后再以文火煎30 min，取藥物濾液，減壓濃縮至100%水煎液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有藥物的家兔用量按人和?dòng)物間等效劑量換算方法折算[1]，得出家兔的白虎湯等效劑量為5 g/kg。

1.2動(dòng)物普通級(jí)新西蘭白兔32只,雌雄各半，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào):SCXK(魯)20040013。

1.3試劑與儀器大腸桿菌內(nèi)毒素(ET，Escherichia coli 0127∶B8)購(gòu)于Sigma Aldrich公司；血清型0127∶B8，用前以生理鹽水稀釋成5 μg/mL的溶液。IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子TNF-αELISA試劑盒，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的鼠抗兔CD4和CD8單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(進(jìn)口分裝)。標(biāo)準(zhǔn)溫度計(jì)，上海醫(yī)用儀表廠；微量移液器，德國(guó)艾本德(eppendorf)；DDL-5低溫離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；MDF-D5410三洋低溫冰箱,日本三洋公司生產(chǎn)；381MC型酶標(biāo)儀，上海三科儀器有限公司;BECTON DICKINSON流式細(xì)胞儀。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組、造模與體溫測(cè)定將32只家兔隨機(jī)分為正常組、模型組、白虎湯高劑量組、白虎湯低劑量組，每組各8只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d。造模前24 h將動(dòng)物置于家兔固定箱內(nèi)，測(cè)溫時(shí)將涂有石蠟油的體溫計(jì)插入直腸內(nèi)，待動(dòng)物穩(wěn)定后記錄體溫，每隔30 min測(cè)溫1次，取3次的均值作為家兔基礎(chǔ)體溫。取平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，條件齊同者納入實(shí)驗(yàn)程序。第3天,白虎湯高劑量組、低劑量組(20，10 g/kg)分別以等效劑量4倍、2倍的藥物灌胃1次，正常組、模型組灌喂等量生理鹽水，連續(xù)5 d，第7晚喂飼后各組禁食禁水。第8天，除正常組外，其余各組動(dòng)物皆按照文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行造模，每只動(dòng)物由耳緣靜脈注入大腸桿菌內(nèi)毒素液200 μg/kg，正常組注入等量生理鹽水。觀察各組動(dòng)物的耳、皮膚、結(jié)膜、舌、渴飲、攝食、神志及全身狀態(tài)等的變化情況。監(jiān)測(cè)各組動(dòng)物分別于造模后5 h內(nèi)體溫,每0.5 h各測(cè)定肛溫1次。體溫測(cè)試采用ST-1型數(shù)字體溫計(jì)(上海醫(yī)用儀表廠)。觀察3 h溫差(ΔT3=體溫上升的最高值一基礎(chǔ)體溫值)及5 h體溫指數(shù)(TRI5=體溫變化曲線下面積)。

2.2檢測(cè)指標(biāo)5 h后由耳緣靜脈采血，取6 mL血，分別加入2只2% EDTA-Na2抗凝的試管中，取抗凝全血1 mL，加100 μL單抗，避光15 min，加入紅細(xì)胞裂解液0.5 mL，室溫放置10 min，以1 000 r/min離心10 min，取沉淀以PBS洗2遍，棄上清，加入10 mL PBS混勻后上機(jī)檢測(cè)。一只試管顛倒搖勻后置于4 ℃、3 000 r/min的離心機(jī)中離心10 min,吸取上層血清，保存于-70 ℃冰箱中。血清中細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)水平的檢測(cè)均依照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1癥狀與體征模型組動(dòng)物在造模后30 min～1 h開始發(fā)熱，并出現(xiàn)聳毛、發(fā)抖、蜷縮；2 h后模型組體溫明顯上升，呼吸急促，部分家兔出現(xiàn)稀便；3 h體溫達(dá)到最高點(diǎn)，大部分家兔出現(xiàn)呼吸困難，口唇紫紺，結(jié)膜充血，精神萎靡，癱臥或抽搐驚跳，舌質(zhì)紫暗或呈紫灰色，但結(jié)膜及皮下未見出血點(diǎn)及疲斑，耳緣注射處也未見出血。白虎湯低劑量組家兔上述表現(xiàn)不如模型組嚴(yán)重，仍可見呼吸急促，心跳加快，舌質(zhì)偏紅；白虎湯高劑量組家兔可見呼吸急促、精神差，但無心跳快、結(jié)膜充血及舌質(zhì)偏紅。正常組家兔均未見上述異常表現(xiàn)。提示白虎湯能改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的癥狀和體征。

3.2白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔體溫的影響見表1。

組 別劑量/(g/kg)ΔT3/℃TRI5/cm2正常組 —0.26±0.02 8.27±3.40 模型組 —1.71±0.26## 53.26±17.33## 白虎湯低劑量組100.91±0.15##△28.07±4.54##△白虎湯高劑量組200.71±0.23#△△16.07±5.64#△△

注：與正常組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01

3.3白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響見表2。

表2　白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響

注：與正常組相比，#P<0.05，##P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01

3.4白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的影響見表3。

表3　白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔CD4 +、CD8 +、CD4 +/CD8 +的影響

注:與正常組相比,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01

4討論

溫病的發(fā)生除有外邪——溫?zé)岫拘案腥就?，還取決于機(jī)體正氣的強(qiáng)弱及外界環(huán)境因素的變化。造模時(shí)，首先要使模型具備溫病氣分證的基本病理特征。內(nèi)毒素可以作用于許多動(dòng)物建立模型，但家兔對(duì)內(nèi)毒素極為敏感，而且家兔對(duì)內(nèi)毒素的生物學(xué)反應(yīng)與人類相似，因此筆者選擇家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，攻毒材料筆者選用大腸桿菌內(nèi)毒素。據(jù)研究表明，內(nèi)毒素不僅可以直接造成組織損傷，更重要的是還能激活內(nèi)生致熱原細(xì)胞產(chǎn)生和釋放EP引起體溫的升高[3]。EP指的是多種致熱性細(xì)胞因子，在發(fā)熱中起著十分重要的作用[4]。IL-6在炎癥期間能引起發(fā)熱，它有序地產(chǎn)生，有規(guī)律地釋放[5],由IL-1β誘導(dǎo)，能通過血流經(jīng)血腦屏障到達(dá)大腦。IL-1β是參與多種致熱原性發(fā)熱的重要細(xì)胞因子[6],它可以激活腦內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)、IL-6等介導(dǎo)下丘腦視前區(qū)的發(fā)熱，還可刺激下丘腦合成、釋放可引起動(dòng)物體溫明顯升高的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH),也能直接入腦，作用于下丘腦的體溫調(diào)定點(diǎn)引起發(fā)熱[7]。

TNF-α是一種內(nèi)生致熱原[8]，可直接刺激體溫調(diào)節(jié)中樞或間接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量IL-1引起發(fā)熱[9]，還可以使下丘腦組織中誘導(dǎo)發(fā)熱的中樞介質(zhì)PGE2明顯增多。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為正氣存內(nèi)，邪不可干，這里的正氣包括了免疫功能在內(nèi)的一切抗病能力。免疫細(xì)胞及其亞群的計(jì)數(shù)、活性的測(cè)定以及細(xì)胞因子的檢測(cè)等是衡量機(jī)體免疫功能的重要技術(shù)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：模型組TNF-α、ET、IL-1β、IL-6、CD8+明顯升高，CD4+水平與CD4+/CD8+比值顯著下降，說明內(nèi)毒素可以導(dǎo)致激活內(nèi)生致熱原細(xì)胞產(chǎn)生和釋放EP引起體溫的升高并導(dǎo)致家兔免疫功能下降。白虎湯高、低劑量組均能明顯抑制血清中TNF-α、ET、IL-1β、IL-6的含量升高(P<0.01)，提升CD4+水平與CD4+/CD8+比值(P<0.01)，降低CD8+水平(P<0.01)，說明白虎湯是通過減少TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放，清除ET，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能來達(dá)到解熱效應(yīng)的。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，白虎湯對(duì)內(nèi)毒素致熱家兔有良好的解熱作用，其機(jī)制可能是通過抑制發(fā)熱家兔致熱性細(xì)胞因子的釋放，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而發(fā)揮其解熱的作用。

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