·實(shí)驗(yàn)研究·

靈芝多糖對(duì)癲癇大鼠腦中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響

朱孔利，謝莉莉，劉輝

(南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校 ，江蘇 南通 226007)

摘要：目的觀察和探討靈芝多糖干預(yù)后戊四氮(PTZ)致癇大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)GLAST (EAAT1)、GLT1 (EAAT2)、EAAC1(EAAT3)的變化,進(jìn)一步研究癲癇的發(fā)病機(jī)制及靈芝多糖的作用機(jī)制。方法SD大鼠32只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、癲癇模型組、靈芝多糖組和卡馬西平組,每組8只。癲癇組、靈芝多糖組和卡馬西平組采用PTZ腹腔注射制作慢性癲癇點(diǎn)燃模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后斷頭迅速取腦,采用免疫組化法檢測(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)各指標(biāo)的變化。結(jié)果癲癇模型組大鼠腦中GLAST、GLT1、 EAAC1的表達(dá)較正常對(duì)照組降低：皮質(zhì)(31.87±4.76)、( 48.00±5.34),( 42.87±4.01)、( 52.12±3.75),( 40.25±2.81)、(46.87±3.04)；海馬:(29.87±4.32)、( 44.51±4.81), (36.50±3.02)、( 47.00±3.20),( 35.62±3.42)、(42.12±3.56)；靈芝多糖和卡馬西平組大鼠腦中GLAST1、GLT1、 EAAC1的表達(dá)較癲癇模型組升高:皮質(zhì)(40.50±4.47)、( 31.87±4.76),( 48.87±3.48)、( 42.87±4.01),( 43.87±2.53)、(40.25±2.81)；海馬:(37.75±3.61)、( 29.87±4.32),( 41.25±2.60)、 (36.50±3.02),( 39.50±2.61)、(35.62±3.42)。靈芝多糖組和卡馬西平組之間GLAST1、GLT1、EAAC1三者的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論靈芝多糖能夠升高癲癇大鼠腦中GLAST、GLT1、EAAC1的表達(dá)，加速了興奮性氨基酸Glu(谷氨酸)的清除。降低神經(jīng)元興奮性、減少神經(jīng)系統(tǒng)損傷而抑制癲癇的發(fā)作。

關(guān)鍵詞：癲癇；谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體；靈芝多糖

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.002

中圖分類號(hào)：R285．5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2015)06-1104-03

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生科研項(xiàng)目(JZ201319)。

作者簡(jiǎn)介：朱孔利(1979-)，女，碩士，講師，主要從事癲癇的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防研究。

收稿日期:(2015-05-26)

Ganoderma lucidum polysaccharide on excitatory amino acid transporter in brain of epileptic rat

ZHU Kongli, XIE Lili, LIU Hui

(Nantong Vocational and Technical College of Health, Nantong 226007, Jiangsu Province, China)

Abstract：ObjectiveTo observe and investigate the influence of ganoderma lucidum polysaccharide on GLAST, GLT-1 and EAAC1 in the cortex and hippocampus of epileptic rat. Study on the pathogenesis of epilepsy and the mechanism of action of ganoderma lucidum polysaccharide. MethodsThe 32 SD rats were randomly divided into normal control group, epilepsy model group, ganoderma lucidum polysaccharides and carbamazepine group, each group of eight. The rats of epilepsy model group, ganoderma lucidum polysaccharides and carbamazepine group made by intraperitoneal injection of pentetrazole (PTZ). After the experiment, get the rats brain tissue quickly. Using immunohistochemical and colorimetry to detect the index changes of cortex and hippocampus. ResultsGLAST1，GLT1， EAAC1 in the brain of epileptic rat lower in epilepsy model group than the normal control group:cortex(31.87±4.76),( 48.00±5.34),(42.87±4.01),(52.12±3.75),(40.25±2.81),(46.87±3.04);hippocampus(29.87±4.32),(44.51±4.81), (36.50±3.02),(47.00±3.20), (35.62±3.42),(42.12±3.56); GLAST, GLT-1, EAAC1 in the brain of epileptic rat higher in ganoderma lucidum polysaccharides group and carbamazepine group than the epilepsy model group:cortex(40.50±4.47),(31.87±4.76),(48.87±3.48),(42.87±4.01),(43.87±2.53),(40.25±2.81);hippocampus(37.75±3.61),(29.87±4.32),( 41.25±2.60),(36.50±3.02),(39.50±2.61),(35.62±3.42); GLAST1, GLT1, EAAC1 were no significant differences in ganoderma lucidum polysacchairides group and carbamazepine group. ConclusionGanoderma lucidum polysaccharide can increase the GLAST，GLT-1 and EAAC1 in the epileptic rats brain tissue, speed up the process of eliminating glutamic acid.

Keywords：epilepsy; EAAT; Ganoderma lucidum polysaccharide

癲癇是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，腦部最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì) Glu(谷氨酸)的升高在癲癇發(fā)生中起一定作用，可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。而細(xì)胞外Glu 的清除主要依賴于高親和力的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAATs)。迄今為止已克隆出5種位于細(xì)胞膜的興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)，分 別 為 GLAST(EAAT1)、GLT-1 (EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4、EAAT5。靈芝含有豐富的氨基酸和微量元素，可通過免疫調(diào)節(jié)，抗氧化，清除自由基，抑制凋亡，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等方面發(fā)揮抗癲癇作用。靈芝多糖由肽多糖、葡聚糖、雜多糖等多糖均一體組成的混合物，是靈芝主要有效成分之一[1]，本實(shí)驗(yàn)擬研究靈芝多糖對(duì)癲癇大鼠大腦中GLAST、GLT1、EAAC1的影響，進(jìn)一步探討癲癇的發(fā)病機(jī)制及靈芝多糖的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料1.1.1動(dòng)物雄性SD大鼠32只(鼠齡12周)，體質(zhì)量180～220 g，普通級(jí)動(dòng)物，由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。1.1.2主要儀器與試劑戊四氮(PTZ)：美國(guó)sigma公司；靈芝多糖：上海康舟真菌多糖有限公司；兔抗大鼠GLAST、兔抗大鼠GLT-1和兔抗大鼠EAAC1均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；成像系統(tǒng)：BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟生物科技公司)。1.2方法1.2.1癲癇模型及動(dòng)物處理大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組、癲癇模型組、靈芝多糖組和卡馬西平組。灌胃前禁食6 h。癲癇模型組PTZ腹腔注射加生理鹽水灌胃；靈芝多糖組PTZ腹腔注射加靈芝多糖灌胃；卡馬西平組PTZ腹腔注射加卡馬西平混懸液灌胃；正常對(duì)照組生理鹽水腹腔注射加生理鹽水灌胃。腹腔注射劑量為35 mg/kg，靈芝多糖灌胃劑量為150 mg/kg，1 次/d，卡馬西平灌胃計(jì)量為15 mg/kg的混懸液，2次/d，持續(xù)28 d。觀察大鼠的行為變化，記錄癲癇發(fā)作情況。按照驚厥發(fā)作評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]，凡顯示連續(xù)5次Ⅱ級(jí)以上驚厥的大鼠為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)。1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后心臟灌注斷頭，取腦，甲醛固定、包埋、切片、封片，用于免疫組化。SABC法檢測(cè)皮質(zhì)和海馬區(qū)GLAST、GLT-1和EAAC1的免疫反應(yīng)性;正常組實(shí)驗(yàn)省去第Ⅰ抗，以PBS代替，孵育切片。光鏡下觀察 ，胞膜顯示棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片選擇 5 個(gè)具有代表性的高倍視野(×400)，計(jì)算染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，均數(shù)間顯著性差異判定使用SPSS Statistics 17．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)過程中，癲癇模型組、靈芝多糖組和卡馬西平組實(shí)驗(yàn)大鼠均有連續(xù)多次的Ⅱ～I(xiàn)V級(jí)癲癇發(fā)作，均達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，癲癇模型制作成功。初期大鼠的癲癇發(fā)作基本上每次腹腔注射戊四氮后1～3 min出現(xiàn)，5～7 min 達(dá)到高峰，一般30 min后很少再有抽搐發(fā)作。靈芝多糖組和卡馬西平組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期明顯延長(zhǎng)，發(fā)作時(shí)間縮短。正常對(duì)照組生理鹽水腹腔注射及灌胃前后無(wú)明顯變化。2.2各組皮質(zhì)和海馬區(qū)GLAST的表達(dá)見表1。

表1　大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)GLAST陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較( ± s, n=8)個(gè)/高倍視野

表1　大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)GLAST陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較( ± s, n=8)個(gè)/高倍視野

組 別皮 質(zhì)海 馬正常組48.00±5.34##44.51±4.81##模型組31.87±4.76 29.87±4.32 靈芝組40.50±4.47# 37.75±3.61# 卡馬組38.12±4.22# 35.62±3.06#

注：與模型組比較，#P<0.05; ##P<0.01

2.3各組皮質(zhì)和海馬區(qū)GLT-1的表達(dá)見表2。

表2　大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)GLT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較( ± s, n=8)個(gè)/高倍視野

表2　大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)GLT-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較( ± s, n=8)個(gè)/高倍視野

組 別皮 質(zhì)海 馬正常組52.12±3.75##47.00±3.20##模型組42.87±4.01 36.50±3.02 靈芝組48.87±3.48# 41.25±2.60# 卡馬組46.12±4.85# 38.12±3.09#

注：與模型組比較，#P<0.05; ##P<0.01

2.4各組皮質(zhì)和海馬區(qū)EAAC1的表達(dá)見表3。

表3　大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)EAAC1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較( ± s, n=8)個(gè)/高倍視野

表3　大鼠大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)EAAC1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較( ± s, n=8)個(gè)/高倍視野

組 別皮 質(zhì)海 馬正常組46.87±3.04##42.12±3.56##模型組40.25±2.81 35.62±3.42 靈芝組43.87±2.53# 39.50±2.61# 卡馬組44.62±2.13# 40.75±2.43#

注：與模型組比較，#P<0.05; ##P<0.01

3討論

谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。用遺傳學(xué)手段高表達(dá)或者藥理學(xué)手段上調(diào)GLT-1的表達(dá)和功能可以增加谷氨酸的攝取能力并減輕谷氨酸引起的細(xì)胞死亡[3]。乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的減少可引起谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT1)的減少，導(dǎo)致腦內(nèi)谷氨酸水平升高，提高神經(jīng)元興奮性，導(dǎo)致癲癇發(fā)作[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中TSC1失活的小鼠腦中的GLT-1和GLAST蛋白量都明顯降低，同時(shí)表現(xiàn)出癲癇行為，可能是由于TSC1的失活導(dǎo)致谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的紊亂，引起癲癇發(fā)作。7β-羥基膽固醇可抑制海馬區(qū)域膠質(zhì)細(xì)胞增生、提高 GLAST 和 GLT1的表達(dá)，對(duì)創(chuàng)傷性癲癇起到治療作用[6]。癲癇大鼠顳葉皮層中 GLAST 和 GLT-1 在靜息期表達(dá)水平下調(diào)，嚴(yán)重影響 Glu 的清除機(jī)制，二者可能共同參與癲癇發(fā)生過程中的突觸重構(gòu)，引起癲癇敏感性增加。癲癇持續(xù)狀態(tài)的大鼠海馬神經(jīng)元遭受損傷，TBOA可阻滯GLAST 、GLT1和EAAC1 ，導(dǎo)致谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能障礙，加重神經(jīng)元損傷，對(duì)海馬區(qū)突觸的可塑性產(chǎn)生影響[7]。研究[8]顯示，EAAC1 在急性期和靜息期早期表達(dá)增加。而 SIMANTOV等[9]發(fā)現(xiàn)在癲癇大鼠海馬中 EAAC1 mRNA 及蛋白在癲癇早期表達(dá)呈下降趨勢(shì)。SEPKUTY等[10]研究證實(shí)大鼠 EAAC1 基因敲除后，導(dǎo)致Glu 轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，促使癲癇發(fā)生。Guo 等[11]發(fā)現(xiàn) EAAC1 蛋白及 mRNA 的表達(dá)在SERs中無(wú)明顯變化。 本研究發(fā)現(xiàn)，戊四氮致癲癇大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)GLAST、GLT-1、 EAAC1的表達(dá)水平明顯低于正常組，用靈芝多糖和卡馬西平干預(yù)的大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)GLAST、GLT-1、 EAAC1的表達(dá)水平較癲癇模型組明顯升高，靈芝多糖組和卡馬西平組之間GLAST、GLT-1、EAAC1三者的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)行為學(xué)顯示：癲癇大鼠發(fā)作的潛伏期明顯延長(zhǎng)，發(fā)作時(shí)間縮短，說明靈芝多糖可能通過升高GLAST、GLT-1、 EAAC1的表達(dá)來降低神經(jīng)元興奮性，減輕或抑制癲癇發(fā)作。

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