研究報(bào)告

姜黃素抑制人宮頸癌CaSki細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長

劉冬菊1,姚宇1，黃文革2

(1． 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院, 廣州510360; 2. 中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州510080)

【摘要】目的探討姜黃素對(duì)人宮頸癌CaSki細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的抑制作用。方法建立人宮頸癌裸鼠皮下移植瘤模型，35只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，姜黃素高劑量(200 mg/kg)、中劑量(100 mg/kg)、低劑量(50 mg/kg)組、溶劑對(duì)照組和順鉑組(3 mg /kg)，每組7只，姜黃素連續(xù)灌胃給藥15 d，順鉑組每3 d腹腔注射給藥，共5次。停藥24 h后處死裸鼠，測(cè)量裸鼠體重、移植瘤體積、瘤重，計(jì)算抑瘤率；光鏡下觀察移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化；結(jié)果處理組的移植瘤體積均明顯小于空白對(duì)照組(P

【關(guān)鍵詞】宮頸癌；姜黃素；移植瘤

[基金項(xiàng)目]廣東省科技計(jì)劃

[通訊作者]劉冬菊(1971-)，女，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事婦科腫瘤的研究。Email: weila_dongju@163.com。

【中圖分類號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.002

Inhibitory effect of curcumin on the growth of human cervical

carcinoma (CaSki) xenografts in nude mice

LIU Dong-ju1，YAO Yu1，HUANG Wen-ge2

(1. the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510360, China；

2. Laboratory Animal Center of Zhongshan University, Guangzhou 510080)

Abstract【】ObjectiveTo study the inhibitory effect of curcumin on the growth of human cervical carcinoma CaSki xenografts in nude mice. MethodsHuman cervical cancer cell line CaSki cells were inoculated subcutaneously into nude mice. Thirty-five tumor-bearing mice were randomly divided into 5 groups: curcumin high dose (200 mg/kg), moderate dose (100 mg/kg), low dose (50 mg/kg), solvent control group and cisplatin group (3 mg/kg), 7 mice in each group. Curcumin was orally administered once per day for consecutive 15 days. Intraperitoneal injection of cisplatin was given every three days, for a total of five times. The mice were sacrificed 24 h after the end of treatment and the body weight, tumor volume, tumor weight were measured and the inhibition rate was calculated. The histological changes of tumor tissue was examined. Results The tumor volumes of the treated group were significantly lower than that of the control group (P<0.01). The tumor inhibition rate of the curcumin high, medium and low dose groups were 44.3%, 40.1% and 33.3%, respectively. Apparent necrosis was observed in the tumors of the curcumin-treated groups. ConclusionCurcumin possesses apparent inhibitory effect on the growth of transplanted tumors of human cervical cancer CaSki cells in nude mice.

【Key words】Cervical cancer; Curcumin; Xenografts; Nude mice

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率居女性惡性腫瘤第二位。我國每年子宮頸癌新病例數(shù)為13.15萬，約占全球總數(shù)的1/3，每年有2萬～3萬婦女死于子宮頸癌。以順鉑為基礎(chǔ)的化放療晚期及轉(zhuǎn)移宮頸癌主要的治療方式。順鉑嚴(yán)重的消化道反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性及骨髓移植的不良反應(yīng)使其在臨床應(yīng)用受到限制。因此迫切需要尋找并研究高效無毒副作用的新藥。大量研究發(fā)現(xiàn)中藥姜黃素(curcumin)具有多種生物學(xué)活性，是一種具有良好發(fā)展前景的藥物。它具有抗癌廣譜、不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)，已成為目前研究熱點(diǎn)。本文主要探討姜黃素對(duì)人宮頸癌CaSki細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的作用。

1材料和方法

1.1細(xì)胞.、藥品及主要試劑

人宮頸癌CaSki細(xì)胞購于廣州龍龍生物科技有限公司。姜黃素(Sigma公司)；注射用鹽酸順鉑 (齊魯制藥有限公司)；BD Matrigel：購于廣州龍龍生物科技有限公司。1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自Gibco公司；

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)BALB/c nu/nu 雌性裸小鼠35只，4～5 周齡，體質(zhì)量 (15～20) g，購于中山大學(xué)(大學(xué)城)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)合格證編號(hào)：SCXK(粵)2011-0029。動(dòng)物級(jí)別SPF級(jí)，N0：44008500006263。所有裸鼠均由中山大學(xué)(北校區(qū))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)： SYXK(粵)2012-0081。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：人宮頸癌CaSki細(xì)胞常規(guī)進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2裸鼠的飼養(yǎng)：裸鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度40%～60%。實(shí)驗(yàn)用裸鼠所用的墊料、食物、水等均經(jīng)過滅菌處理。

1.2.3人宮頸癌CaSki細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的建立：Caski細(xì)胞以2×106個(gè)細(xì)胞鋪至10 cm2的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后用0.25%胰酶消化消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，離心，用無血清的培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，并計(jì)算好所需細(xì)胞，取出并離心；取出溶解的Matrigel(濃度為100%)，用無血清的培養(yǎng)基稀釋至50%；按照細(xì)胞懸液：50% Matrigel=1∶1混勻。Matrigel終濃度為25%，細(xì)胞密度為2×106個(gè)/200 μL；酒精消毒后,用1.0 mL注射器將0.2 mL細(xì)胞懸液(約2.0×106細(xì)胞)注入裸鼠右側(cè)腋窩處皮下。待移植瘤大小約100 mm3，按數(shù)字隨機(jī)法分為5組，每組7只，進(jìn)行給藥。①溶劑對(duì)照組：0.5%羧甲基纖維素鈉0.2 mL；② Curcumin低劑量組：50 mg/kg；③ Curcumin中劑量組：100 mg/kg；④ Curcumin高劑量組：200 mg/kg；⑤順鉑組，順鉑3 mg/kg。順鉑組腹腔注射，每3 d 1次，其余各組每天灌胃1次，共15 d。

1.2.4腫瘤體測(cè)量及抑瘤率的計(jì)算：定期觀察小鼠的飲食、精神、排便情況，于給藥前一日及給藥后每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長徑(a)、短徑(b)；給藥前用電子天平測(cè)量裸鼠體質(zhì)量。停藥后24 h，將裸鼠頸椎脫臼法處死，剝?nèi)×鼋M織，可見部分裸鼠腫瘤旁有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，稱重瘤組織，常規(guī)剖腹觀察未見腹水及其它臟器轉(zhuǎn)移，稱瘤體重量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(IR%)=[(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重] × 100%。按以下公式計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積(V)=ab2/2。

1.2.5移植瘤組織病理學(xué)觀察：取瘤后，10%中性甲醛液固定，標(biāo)本經(jīng)脫水、包埋、切片，HE染色。用Leica DM5000B普通光學(xué)顯微鏡觀察各組課鼠移植瘤組織及心、肝、肺、腎等組織標(biāo)本的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，瘤體生長曲線采用重復(fù)測(cè)量方差分析，不同組間比較采用One-way ANOVA分析。

2結(jié)果

2.1裸鼠成瘤情況及各治療組對(duì)裸鼠移植瘤生長的抑制作用

裸鼠接種CaSki后，5～7 d可見直徑約2～3 mm的瘤樣結(jié)節(jié)，質(zhì)地軟。繼續(xù)觀察接種第15 天，瘤樣結(jié)節(jié)質(zhì)地漸硬，本實(shí)驗(yàn)35只裸鼠成瘤率為100%。按裸鼠腫瘤體積大小隨機(jī)分5組，每組7只, 治療前各組裸鼠平均體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)。

2.2荷瘤裸鼠治療前后體質(zhì)量的變化

用藥期間，順鉑組小鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少，厭食，皮膚干澀，消瘦等表現(xiàn)。其余各組一般狀況良好，未見藥物不良反應(yīng)。經(jīng)過15 d治療，各組裸鼠的平均體重如表1：示，順鉑組與對(duì)照組相比，裸鼠體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)，姜黃素各治療組裸鼠體重與對(duì)照組及之前相比，并無明顯變化(P>0.05)。

表1　各組裸鼠體重、腫瘤體積、瘤重的變化 ± s)

與對(duì)照組比較aP<0.05，與姜黃素低劑量組比較bP<0.05

Note. Compared with the control group,aP<0.05. Compared with the curcumin low dose group,bP<0.05.

2.3各處理組裸鼠腫瘤體積變化

接種瘤細(xì)胞后各組腫瘤體積均逐漸增大，對(duì)照組腫瘤體積增長較快，各治療組移植瘤體積均小于對(duì)照組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著姜黃素治療劑量的增高，移植瘤體積減緩。姜黃素低劑量組腫瘤體積與順鉑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。姜黃素中、高劑量組與順鉑比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(表1，圖1)。

2.4各處理組裸鼠腫瘤生長抑制率和瘤重的比較

順鉑組腫瘤生長抑制率為54.3%，姜黃素低、中、高劑量組抑制裸鼠CaSki皮下移植瘤的抑制率分別為33.3%、40.1%、44.3%，見表1。在治療終點(diǎn)，各治療組移植瘤質(zhì)量比對(duì)照組均有降低，順鉑組與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而姜黃素組與對(duì)照組比較則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。姜黃素各處理組瘤重與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，順鉑組瘤重與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　裸鼠宮頸癌的生長曲線( ±s， n=7) Fig.1　The growth curves of transplanted cervical tumor in the nude mice( ±s, n=7)

2.5裸鼠移植瘤組織的病理學(xué)觀察

各組腫瘤細(xì)胞呈漩渦狀、簇團(tuán)狀生長，被增生的纖維組織間隔，腫瘤細(xì)胞呈圓形或卵圓形，核大，核仁清晰，部分腫瘤細(xì)胞胞漿可見空泡，瘤團(tuán)間可見壞死灶形成。隨姜黃素治療劑量的增高，瘤組織的壞死區(qū)域逐漸增大(圖2，見文后彩插1)。

3討論

姜黃素(curcumin)是從姜科植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、預(yù)防血栓和抗腫瘤的多種生物學(xué)效應(yīng)[1-3]。美國國立癌癥研究所已經(jīng)用姜黃素進(jìn)行I期臨床試驗(yàn)[4]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)姜黃素對(duì)胃癌[5]肺癌[6]乳腺癌[7]等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用。目前認(rèn)為姜黃素能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)環(huán)節(jié)與步驟，抗腫瘤機(jī)制也是多方面的。

姜黃素可通過調(diào)控Bcl-2基因家族及激活p53蛋白等方式，抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；姜黃素還可通過抑制NF-KB活化、抑制STATs通路、抑制MAPK通路等不同的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯；徐嘮等[8]研究表明姜黃素能抑制人宮頸癌CaSki細(xì)胞生長, 降低CaSki細(xì)胞侵襲和遷移能力,其機(jī)制與降低MMP-2，MTl-MMP and NF-KB的表達(dá)有關(guān)。

以上均為姜黃素體外實(shí)驗(yàn)研究，而姜黃素體內(nèi)實(shí)驗(yàn)國內(nèi)外研究報(bào)道較少。通過對(duì)人類非小細(xì)胞肺癌動(dòng)物研究，發(fā)現(xiàn)姜黃素降低了原位人類非小細(xì)胞肺癌裸鼠腫瘤的生長，增加了無胸腺小鼠的生存期，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其機(jī)制與姜黃素抑制COX-2，p65的表達(dá)，降低ERK1/2的活性有關(guān)[9]。

我們通過建立人宮頸癌Caski細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型，研究不同劑量的姜黃素治療腫瘤效果，實(shí)驗(yàn)中采用了0.5%羧甲基纖維素鈉作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞毒藥物順鉑為陽性對(duì)照，對(duì)不同濃度姜黃素治療療效進(jìn)行觀察評(píng)估。

通過對(duì)各處理組生長曲線和與陰性對(duì)照組比較，以及處理后平均瘤重比較，結(jié)果顯示姜黃素對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠移植瘤生長有抑制作用。高、中、低濃度組的姜黃素的腫瘤抑制率分別為44.3%、40.1%和33.3%，用藥的效果呈劑量依賴性，隨姜黃素劑量的增加，抑瘤效果增強(qiáng)(表1)。用藥期間荷瘤鼠沒有進(jìn)食減少、行動(dòng)遲緩、消瘦，體表溫度下降等副反應(yīng)，說明姜黃素安全性高、無毒副作用。并且HE染色病理檢查發(fā)現(xiàn)(圖2)，隨姜黃素治療劑量的加大，瘤團(tuán)間可見壞死灶的比例增大,與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；這說明姜黃素通過破壞移植瘤周圍的血管上皮組織，導(dǎo)致血栓的形成，阻斷移植瘤的血液營養(yǎng)供應(yīng)，最終導(dǎo)致腫瘤的出血性壞死、消退或消失。Yoysungnoen-Chintana P等[10]研究發(fā)現(xiàn)高劑量姜黃素具有抑制宮頸癌CaSki細(xì)胞裸鼠腫瘤的生長和血管生成的作用，其機(jī)制是通過下調(diào)CaSki細(xì)胞裸鼠移植瘤血管內(nèi)皮生長因子、COX-2和EGFR的表達(dá)，并認(rèn)為姜黃素對(duì)宮頸癌具有治療作用。

本研究結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的的生長具有抑制作用。為姜黃素成為新型抗腫瘤藥及臨床治療宮頸癌提供了理論依據(jù)，姜黃素抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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[10]Yoysungnoen-Chintana P, Bhattarakosol P, Patumraj S. Antitumor and antiangiogenic activities of curcumin in cervical cancer xenografts in nude mice [J]. Biomed Res Int. doi: 10.1155/2014/817972. Epub 2014 Apr 16.

〔修回日期〕2014-11-04