時(shí)小艷

摘要：建立一種采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定加工肉制品中吲哚殘留量的新方法。樣品經(jīng)純甲醇提取后，采用HLB固相萃取柱凈化，用高效液相色譜C18柱分離，水-乙腈作為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm，外標(biāo)法定量。吲哚的濃度在10～100 μg/L內(nèi)有較好的線性關(guān)系，R2大于0.99，回收率為93.5%～97.4%，RSD小于15%（n=10）。該法簡(jiǎn)單，靈敏度高，重復(fù)性好，適用于動(dòng)物源性食品中吲哚殘留量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞： 吲哚; 高效液相色譜; 殘留

中圖分類號(hào)：O657.7+2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-6015-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.056

Content Determination of Indole in Meat Products Processing by HPLC

SHI Xiao-yan

（Department of Career Technical， Jiangsu Food and Drug of Medicine and Health Management College， Huaian 223003， Jiangsu， China）

Abstract： To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for determination of indole residues in meat food， samples were extracted with methanol， purified with HLB solid phase extraction column， separated by C18 chromatography column. Water-acetonitrile was acted as the mobile phase with gradient elution， the flow rate was 1.0 mL/min， column temperature was 30 ℃，the detection wavelength was 275 nm with external standard method. Indole concentration in 10～100 g/L had good linear relationship， regression coefficient was more than 0.99， the recoveries were in the range of 93.5%～97.4%，the relative standard deviation was less than 15%（n=10）. The method was simple， rapid， sensitive， suitable for determination of indole residues in animal origin food.

Key words：indole;high performance liquid chromatography;residues

吲哚是吡咯與苯并聯(lián)的化合物，又稱苯并吡咯，結(jié)構(gòu)如圖1所示。熔點(diǎn)在51～54 ℃之間，密度為1.14 g/cm3[1]。吲哚及其同系物和衍生物廣泛存在于自然界中，主要存在于天然花油中，如茉莉花、水仙花、香羅蘭等中。吲哚是一種重要的有機(jī)原料和精細(xì)化工產(chǎn)品，是動(dòng)物必需氨基酸色氨酸的衍生物，植物生長(zhǎng)素（吲哚-3-乙酸）、抗炎藥物消炎痛、生物堿及色素中也包含有吲哚結(jié)構(gòu)。由于吲哚在化工中被廣泛應(yīng)用，必須控制在允許范圍內(nèi)，避免對(duì)人體健康帶來威脅[2-4]。

高效液相色譜法以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)[5-7]。本試驗(yàn)通過高效液相色譜來測(cè)定肉制品中吲哚的含量，該方法簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)，靈敏度高。

1 ?材料和方法

1.1 ? 材料與試劑

食源性肉制品（市售）;吲哚標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品研究所）;甲醇、乙酸乙酯、乙腈（美國(guó)Sigma公司）;去離子水（Millipore公司）

1.2 ? 儀器和設(shè)備

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）;Oasis HLB固相萃取柱（3 mL/60 mg，美國(guó)Waters公司）;Symmetry C18反相色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm，美國(guó)Waters公司）;高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）;

1.3 ? 標(biāo)準(zhǔn)品配制

準(zhǔn)確稱取吲哚標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.001 g），用甲醇分別溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，制備成100 μg/mL的吲哚標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，4 ℃下冰箱保存。

1.4 ?工作溶液配制

準(zhǔn)確量取一定量吲哚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇定容于100 mL棕色容量瓶中，分別制備成100、80、40、20、10 μg/L的工作溶液。

1.5 ?色譜條件

Symmetry C18反相色譜柱; 柱溫為30 ℃; 流速為1 mL/min; 進(jìn)樣量為10 μL;流動(dòng)相：水∶乙腈（65∶35，V/V）;檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2

1.6 ? 樣本提取

準(zhǔn)確稱取絞好的動(dòng)物源性食品5.00 g，放入到50 mL錐形瓶中，加入甲醇溶液25 mL，超聲提取20 min，4 ℃下6 000 r/min離心15 min，吸取上清液。

1.7 ? 樣本凈化

將HLB固相萃取小柱用5 mL甲醇活化，之后5 mL去離子水平衡，將得到的樣品處理液上固相萃取柱（柱流速保持1 滴/s），用10 mL 蒸餾水、10 mL 5%甲醇水溶液淋洗HLB固相萃取柱，再用10 mL甲醇∶乙酸乙酯（15∶85，V/V）洗脫，將洗脫液用60℃氮?dú)獯蹈珊?，最后?jīng)0.45 μm 濾膜過濾后進(jìn)樣。

1.8 ? 工作曲線和線性關(guān)系分析

將配好的吲哚標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述色譜條件下進(jìn)行上樣。將各個(gè)工作液對(duì)應(yīng)的峰面積作為縱坐標(biāo)，將進(jìn)樣濃度作為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并且施以外標(biāo)法定量。計(jì)算公式如下：

X=■

式中，C為提取吲哚的濃度，mg/mL;V為樣本定容體積，mL;m為樣本稱取質(zhì)量，g;X為樣本中吲哚的含量，mg/kg。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?提取方法的選擇

2.1.1 ?提取溶液的選擇 ?將50%、75%、100%3個(gè)甲醇濃度進(jìn)行提取液比較，在空白樣本中分別加入4 μg和8 μg的吲哚，測(cè)定回收率，每個(gè)樣品平行試驗(yàn)8次。

結(jié)果表明，以100%甲醇為提取液，回收率水平比其他兩組都高，且穩(wěn)定性更好。因此本試驗(yàn)樣品前處理提取液選定為純甲醇。

2.1.2 ?凈化方法的優(yōu)化 ?對(duì)于樣本中吲哚大多采用固相萃取柱的方法凈化，如Merck C18柱、Baker10 C18柱等。本研究中采用甲醇∶乙酸乙酯（15∶85，V/V）作為洗脫液，相比于Merck C18柱、Baker10 C18柱等，HLB固相萃取柱凈化效果最好，回收率高。

2.2 ?色譜條件的選擇

2.2.1 ?最佳柱溫的選擇 ?將柱溫分別設(shè)定為18、25、30、35、40 ℃，其他色譜條件不變，根據(jù)峰面積的大小確定最佳柱溫，結(jié)果見圖3。由圖可見在30 ℃的柱溫條件下，得到最大的峰面積，因此選擇了30 ℃作為柱溫。

2.2.2 ?流動(dòng)相的優(yōu)化 ?當(dāng)只選用30%乙腈作流動(dòng)相時(shí)，各峰的分離度良好，但保留時(shí)間較長(zhǎng)，并且各色譜峰峰形較寬;而當(dāng)45%乙腈作流動(dòng)相時(shí)，各峰保留時(shí)間變短，但色譜峰的分離度變差，綜合考慮，確定乙腈35%作為流動(dòng)相，從圖2可得，在10 min內(nèi)得到有效的分離，并且基線穩(wěn)定，不存在拖尾現(xiàn)象。

2.3 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

以峰面積對(duì)濃度作校正曲線，得線性回歸方程， 發(fā)現(xiàn)吲哚在10～100 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，其線性方程和相關(guān)系數(shù)如表2和圖4所示。

2.4 ?加樣回收率和精密度

分別向適量空白樣品中添加高、中和低3種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一水平做10次平行，室溫下密封放置2 h，添加水平見表3，按上述樣品處理和色譜條件進(jìn)行回收率及精密度試驗(yàn)。結(jié)果可見，回收率為93.5%～97.4%，RSD小于15%，均在允許誤差范圍內(nèi)。

2.5 ?實(shí)際樣本檢測(cè)

將上述方法用于3份實(shí)際樣品的測(cè)定，結(jié)果如表4所示，樣品的平均值為34.79～94.53 mg/kg，RSD為0.3%～1.2%。結(jié)果表明，采用以上條件優(yōu)化得到的檢測(cè)方法適用于肉制品中吲哚殘留量的測(cè)定。

3 ?小結(jié)與討論

本研究探索出了一種基于高效液相色譜儀和HLB固相萃取小柱的測(cè)定動(dòng)物食源性食品中吲哚殘留量的新方法。研究結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，分離完全，3個(gè)添加水平的回收率在93.5%～97.4%，RSD小于15%。該方法具有較高的靈敏度和精密度，重復(fù)性好，適用于肉類中吲哚殘留量的檢測(cè)， 并可提高檢驗(yàn)工作效率和節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間。

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