芪蚣抗纖方及拆方干預(yù)大鼠免疫損傷性肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

梁振鈺，陳桂敏

(海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571101)

摘要：目的觀察芪蚣抗纖方(QF)及拆方對(duì)大鼠免疫損傷性肝纖維化的影響。方法50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、QF全方干預(yù)組、軟堅(jiān)散結(jié)藥干預(yù)組、活血藥干預(yù)組，豬血清攻擊法誘導(dǎo)免疫損傷性肝纖維化大鼠模型，實(shí)驗(yàn)過(guò)程8周。免疫組化法檢測(cè)肝組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)相關(guān)表達(dá)；免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)肝纖維化大鼠TGF-β1和Smad2、Smad3陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果藥物干預(yù)后，治療組TGF-β1含量明顯下降，Smad2、Smad3表達(dá)減少，全方比拆方效果明顯。結(jié)論芪蚣抗纖方及拆方對(duì)TGF-βl和Smads家族蛋白有顯著調(diào)節(jié)作用，可干預(yù)大鼠肝纖維化形成，全方比拆方效果更明顯。預(yù)防和治療肝纖維化除了運(yùn)用常法活血藥與軟堅(jiān)藥，益氣健脾必不可少。

關(guān)鍵詞：芪蚣抗纖方；拆方；肝纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)；Smad2；Smad3

中圖分類(lèi)號(hào)：R 9-33

作者簡(jiǎn)介：尚培中(1964-)，男，河南商丘人，醫(yī)學(xué)碩士，主任醫(yī)師，主要研究方向：普通外科。

基金項(xiàng)目：河北省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科跟蹤項(xiàng)目(No.GL201321)；河北省省級(jí)重大醫(yī)學(xué)科研課題(No.zd2013049)；張家口市科學(xué)技術(shù)與發(fā)展指令計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.1012010D-1)

作者簡(jiǎn)介：張瑛(1977-)，女，河北張家口人，主管護(hù)師，骨科護(hù)士長(zhǎng)。

Experimental Studies in Qigong Kangxian Fang and its Broken Prescriptions on Step in Immunologic Injury of Liver Fibrosis in Rats

LIANG Zhen-yu,CHEN Gui-min

(Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of Qigong Kangxian Fang(QF)and its broken prescriptions on step in immunologic injury of liver fibrosis in rats.MethodsPorcine serum attack method was used to induce immunocomplex induced liver fibrosis rat model，50 male SD rats were randomly divided into five groups:normal control group、model control group、QF intervention group、Softening and Resolving Hard Mass herb intervention group.and promoting blood circulation for removing blood stasis intervention group.The whole experiment process was 8 weeks.TGF-β1,Smad2 and Smad3 of liver tissue were detected with method of immunohistochemistry.ResultsWith Drug intervention,treatment group showed significantly downregulated effect on anti-liver fibrosis factor TGF- β 1 levels,and Smad2,Smad3 expression was reduced.The Effect of QF is obvious than that of its broken prescriptions.ConclusionQigong Kangxian Fang(QF)and its broken prescriptions on rat liver fibrosis induced by transforming growth factor(TGF-β 1)and Smads family proteins have significant moderatin regulation.The intervention for liver fibrosis in rats,can be achieved and QF effect is obvious than that of its broken prescriptions.Therefore,the prevention and treatment of hepatic fibrosis in addition to the use of ordinary law hemorheologic agent and Softening and Resolving Hard Mass herb, is necessary for of replenishing qi to invigorate the spleen.This has certain directive significance to the clinical treatment of liver fibrosis.

Key words:Qigong Kangxian Fang；broken prescriptions；Liver fibrosis；transforming growth factor-β1；Smad2；Smad3

肝病中晚期多以正虛血瘀為病理基礎(chǔ)，立益氣活血、軟堅(jiān)散結(jié)法治療。芪蚣抗纖方(QF)由黃芪、蜈蚣、山慈菇、三七、白術(shù)、桃仁、郁金等七味藥組成，是治療中晚期肝病的有效經(jīng)驗(yàn)方，有良好的保肝、抗肝纖維化(HF)作用。前期研究表明，芪蚣抗纖方對(duì)免疫損傷性肝纖維化大鼠肝損害逆轉(zhuǎn)作用良好，可以影響大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smads信號(hào)通路。本研究主要探討芪蚣抗纖方全方及其拆方干預(yù)肝纖維化的作用，以期為肝纖維化治療組方奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　動(dòng)物與試劑

1.1.1動(dòng)物雄性SD健康大鼠50只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)。許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020。

1.1.2藥品及制備芪蚣抗纖方(QF)全方：黃芪、蜈蚣、山慈姑、三七、白術(shù)等，QF拆方軟堅(jiān)散結(jié)藥(蜈蚣、山慈姑)，QF拆方活血化瘀藥(三七、桃仁、郁金)；全方及拆方均按標(biāo)準(zhǔn)工藝制成顆粒劑備用，每袋10 g，用時(shí)配成液體灌胃(生藥含量1 g·mL-1)。本顆粒劑由河北北方學(xué)院附屬醫(yī)院第一制劑室惠贈(zèng)。

1.1.3免疫組化試劑盒TGF-β1抗體(批號(hào)：BA0290)，Smad2、Smad3(批號(hào)：BA1396)，配套使用稀釋液(1：100)(批號(hào)：SA1022)及DAB顯色劑，均購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。酶免試劑盒TGF-β1(批號(hào)：E0124r)購(gòu)自上海亞培生物制劑有限公司。

1.1.4儀器超凈工作臺(tái)(SW-CJ-IFD型,蘇州凈化設(shè)備廠)，光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)，ELx80O型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)寶特)，RM2235型石蠟切片機(jī)(德國(guó))，LEICA BX50(Olympus)圖像分析儀等。

1.2　分組及方法

50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、模型對(duì)照組(10只)、QF干預(yù)組(10只)、軟堅(jiān)散結(jié)藥干預(yù)組(10只)、活血藥干預(yù)組(10只)。正常對(duì)照組給予生理鹽水2次/周腹腔注射；其余各組均給予豬血清2次/周腹腔注射，誘導(dǎo)肝纖維化模型[3-4]；均注射8周。第5周開(kāi)始，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服生理鹽水20 mL·kg-1，1次·d-1；QF干預(yù)組給予芪蚣抗纖方全方(生藥含量1 g·mL-1)灌胃，10 mL·kg-1，1次·d-1；軟堅(jiān)散結(jié)藥干預(yù)組給予QF拆方軟堅(jiān)散結(jié)藥(生藥含量1 g·mL-1)灌胃，10 mL·kg-1，1次·d-1；活血藥干預(yù)組給予QF拆方活血化瘀藥(生藥含量1 g·mL-1)灌胃，10 mL·kg-1，1次·d-1；連服4周，大鼠給藥劑量按臨床等效劑量與動(dòng)物體質(zhì)量折算而得。實(shí)驗(yàn)過(guò)程共8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,大鼠眼球放血制備血清備用，用于檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)。處死大鼠,于肝左葉取肝組織10%甲醛固定，制作石蠟切片以備免疫組化染色。

1.3　檢測(cè)方法

1.3.1酶標(biāo)儀采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定TGF-β1含量。處死動(dòng)物后，將動(dòng)物血注入塑料離心管內(nèi)，4℃，3 500 r·min-1離心20 min，分離血清，吸入EP管內(nèi)-20℃保存?zhèn)溆?，操作步驟按試劑盒要求，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值(OD值)。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色測(cè)定TGF-β1和Smad2、Smad3陽(yáng)性表達(dá)，免疫組化結(jié)果判定：陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒，采用北京航空航天大學(xué)真色彩病理圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，參照免疫組化顯色標(biāo)準(zhǔn)略修改。每個(gè)指標(biāo)的每個(gè)標(biāo)本,取10個(gè)較好的高倍視野，按顯色程度分弱、中、強(qiáng)3種,分別記以1、2、3分。按顯色范圍分為4度，①+:顯色范圍占高倍視野<25%；②++：顯色占高倍視野25%~50%；③+++：顯色占高倍視野50%~75%；④++++：顯色占高倍視野>75%。將每個(gè)高倍視野顯色程度和范圍換算成“顯色指數(shù)”，顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍(+為1分、++為2分、+++為3分、++++為4分)，取其均數(shù)為每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的最終顯色指數(shù)。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1　酶免法TGF-β1含量測(cè)定結(jié)果比較　

2結(jié)果

2.1　TGF-β1含量比較

與正常組對(duì)照比較，模型對(duì)照組大鼠血清TGF-β1含量明顯升高(P<0.01)；各藥物干預(yù)組可明顯下調(diào)TGF-β1水平(P<0.01)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2　TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)比較

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組、各個(gè)干預(yù)組TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)均增加(P<0.01或P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，QF干預(yù)組TGF-β1、Smad2、Smad3陽(yáng)性表達(dá)均下降(P<0.01)，有接近正常組的趨勢(shì)；軟堅(jiān)干預(yù)組、活血干預(yù)組均能使TGF-β蛋白的表達(dá)減少(P<0.05)；軟堅(jiān)干預(yù)組與模型對(duì)照組Smad2、Smad3表達(dá)比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，活血干預(yù)組與模型對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)(表2)。

表2　TGF-β1和Smad2、Smad3陽(yáng)性表達(dá)比較　

2.3　免疫組織化學(xué)染色比較

正常肝組織中肝竇、胞漿僅微弱表達(dá)TGF-β1，顯色淡(封三圖1)；Smad3胞漿弱陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)染面積<10%。模型對(duì)照組較正常對(duì)照組TGF-β1陽(yáng)性信號(hào)明顯增強(qiáng)，隨著肝纖維化程度的逐步加重，顯色大部分呈深棕黃色(封三圖2)；Smad3胞漿陽(yáng)性表達(dá),核陰性(封三圖3)。藥物干預(yù)后，QF干預(yù)組Smad3陰性(封三圖4)；軟堅(jiān)干預(yù)組TGF-β1陽(yáng)性染色多在胞漿表達(dá)，呈弱陽(yáng)性，程度較模型對(duì)照組有所減輕(封三圖5)；活血干預(yù)組TGF-β1表達(dá)明顯減少，散在分布于受損肝細(xì)胞內(nèi)。

3討論

肝纖維化是常見(jiàn)肝病并發(fā)癥，為機(jī)體對(duì)各種病因引起的慢性肝損傷后的一種損傷修復(fù)反應(yīng)，是影響慢性肝病預(yù)后的重要因素，也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的主要中間環(huán)節(jié)。既往的研究結(jié)果表明芪蚣抗纖方對(duì)免疫損傷性肝纖維化大鼠肝損害逆轉(zhuǎn)作用良好，可以影響大鼠TGF-β1/Smads信號(hào)通路。本研究結(jié)果表明，芪蚣抗纖方全方及其拆方軟堅(jiān)散結(jié)藥與活血藥都有抗肝纖維化的作用，都能使TGF-β1水平明顯下降，Smad2、Smad3表達(dá)減少，QF全方比拆方效果明顯。

但益氣健脾必不可少。芪蚣抗纖方全方具有益氣健脾、活血化瘀、理血軟堅(jiān)之功效，正合肝纖維化的病機(jī)。本研究結(jié)果在肯定全方功效的同時(shí)，對(duì)軟堅(jiān)與活血法治療肝纖維化的探討也為臨床上治療肝纖維化組方思路有一定的指導(dǎo)意義。

目前對(duì)肝纖維化預(yù)防和治療的研究，祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)多為研究藥物在某個(gè)病理環(huán)節(jié)的作用，而對(duì)中藥復(fù)方機(jī)理及篩選中藥中有效成分研究仍較少。本研究主要探討藥物其作用機(jī)理，以期篩選出高效、配伍合理的抗肝纖維化中藥復(fù)方制劑，為指導(dǎo)臨床和開(kāi)發(fā)高效、低毒、配伍科學(xué)的抗纖新藥打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯：李薊龍英文編輯：謝利峰]

通信作者：楊新明(1963-)，男，河北石家莊人，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。