異丙腎上腺素對嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞影響的體外研究

聶晶1， 帕提古麗·買買托合提2， 朱雅琳1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科， 烏魯木齊830054；2新疆和田地區(qū)墨玉縣人民醫(yī)院皮膚科， 新疆和田848000)

摘要：目的探討不同濃度異丙腎上腺素在體外對嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響及β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。方法將增殖期嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分為空白組(不含藥物培養(yǎng)基)及異丙腎上腺素低濃度組(5、10、20 mg/L)與高濃度組(50、100、200 mg/L)。藥物作用1~10 d采用MTT法分別測定各組細(xì)胞的生長曲線。結(jié)果低濃度組24~96 h對細(xì)胞生長呈現(xiàn)刺激作用；96 h時,低濃度組與空白對照組的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而高濃度組在24~96 h對細(xì)胞生長呈現(xiàn)抑制作用，與空白對照相比，高濃度組細(xì)胞的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且24~96 h濃度越高，作用越強(qiáng)。結(jié)論β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)病中有重要作用;異丙腎上腺素對于體外培養(yǎng)的增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用與濃度相關(guān)。

關(guān)鍵詞:嬰兒血管瘤; 血管內(nèi)皮細(xì)胞; 異丙腎上腺素; β-腎上腺素受體

中圖分類號：R969.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.07.010

[收稿日期：2015-02-07]

基金項(xiàng)目：新疆地方病分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(XJDX0208-2011-06)

作者簡介：祖力卡爾江·阿合買提，男(維吾爾族)，碩士，研究方向：齲病學(xué)的防治研究。

The effect of isoproterenol on hemangioma endothelial cells in vitro

NIE Jing1, Patiguli Maimaituoheti2，ZHU Yalin1

(1DepartmentofDermatology,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，

Urumqi830054,China;2DepartmentofDermatology,XinjiangHetian,People′sHospital,

Hetian848000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the different concentrations of isoproterenol in vitro effects on infant hemangioma endothelial cell growth and to study the function of beta adrenergic receptors in the pathogenesis of infantile hemangioma. MethodsInfantile hemangioma endothelial cells in proliferating phase were divided into three groups, the blank group (without drug culture medium), low concentration group(5, 10, 20 mg/L) of isoproterenol and high concentration group (50, 100, 200 mg/L). The growth curve of cells in each group were measured after a certain time by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide (MTT) method. ResultsLow concentration group showed stimulation affection on cell growth within 24-96 hours; and in the high concentration group, cell growth were inhibited within 24-96 hours, and the hiher concentration, the stronger the effect within 24-96 hours. ConclusionBeta adrenergic receptors play an important role in the pathogenesis of infantile hemangioma;stimulation effection of isoproterenol is related with concentration of drug for in vitro culture of hemangioma endothelial cells.

Key words： infant hemangioma; endothelial; isoproterenol; beta adrenergic

血管瘤是由胚胎期血管網(wǎng)增生所形成。在胚胎早期，原始血管是一種單純由內(nèi)皮細(xì)胞組成的管狀物，它們在間質(zhì)中形成一個致密的網(wǎng)。隨著各器官和組織的發(fā)育，原始血管網(wǎng)逐漸分化成為與它們之間聯(lián)系的許多血管叢。根據(jù)原始血管內(nèi)的流量和壓力，形成供應(yīng)血管(動脈)或引流血管(靜脈)。體表和皮下組織的血管網(wǎng)易發(fā)生不規(guī)則的局部增生，日后即成為血管瘤。血管瘤是一種先天性發(fā)育異常，屬于錯構(gòu)瘤性質(zhì)，而非真性腫瘤，具有畸形和腫瘤的雙重特性。嬰兒血管瘤是嬰幼兒最常見的良性腫瘤，大多位于頭頸部，位置較表淺，也有少數(shù)發(fā)生在黏膜、肌肉、骨骼組織和內(nèi)臟，不僅影響美觀，而且影響功能，甚至危及生命。目前血管瘤的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。異丙腎上腺素屬于β-受體拮抗劑，與心得安的作用相拮抗，2008年有研究報(bào)道普萘洛爾(心得安)對血管瘤有明顯療效[1]。因此β-腎上腺素受體在血管瘤發(fā)病中的作用也越來越受到人們的關(guān)注。本研究使用不同濃度的異丙腎上腺素作用于體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，探討不同濃度異丙腎上腺素在體外對嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響及β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1材料與方法

1.1材料血管瘤標(biāo)本來自臨床手術(shù)切除的顳部增殖期血管瘤，患兒女性，9個月。試劑： EGM-2培養(yǎng)基(瑞士LONZA公司)，0.25%胰蛋白酶(美國HyClone公司)，PBS(美國HyClone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原一抗(武漢博士德生物公司)，兔抗人VEGFR-2一抗(武漢博士德生物公司)，HRP多聚抗兔IgG(武漢博士德生物公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物公司)。主要設(shè)備：倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱。

1.2方法

1.2.1血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)手術(shù)切除血管瘤標(biāo)本立即放入1640無血清培養(yǎng)基儲存，并迅速移至實(shí)驗(yàn)室超凈臺。血管瘤標(biāo)本去上清，將標(biāo)本移至無菌培養(yǎng)皿后，使用含雙抗PBS沖洗2遍。沖洗后更換培養(yǎng)皿,繼續(xù)PBS沖洗3遍。在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本修剪，去除表皮、結(jié)締組織，并剪成1 mm×1 mm左右的碎塊，繼續(xù)PBS沖洗2遍。0.25%胰蛋白酶(HyClone)37℃震蕩消化3~4 h，使用含20%胎牛血清1640培養(yǎng)基終止消化，過濾，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，20%胎牛血清1640培養(yǎng)基再次重懸并離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加入EGM-2(LONZA)培養(yǎng)基(含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、氫化考的松、抗壞血酸、人堿性成纖維細(xì)胞生長因子B、人胰島素樣生長因子、表皮生長因子)并移入25 cm2培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱。24 h后觀察細(xì)胞貼壁，換液。隨后每2~3天換液，細(xì)胞鋪滿瓶底70%~80%傳代，所有操作均在超凈臺完成，全程始終無菌操作。

1.2.2血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

1.2.2.1Ⅷ因子相關(guān)抗原(vwf)檢測取原代培養(yǎng)細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，終止后移入離心管離心(1 000 r/min，5 min)，EGM-2培養(yǎng)基重懸，并移入10 cm培養(yǎng)皿中的載玻片上，放入37℃、CO2培養(yǎng)箱爬片。24 h后去上清，PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS沖洗3遍，加封閉液室溫30 min，PBS沖洗，加一抗兔抗人vwf多克隆抗體4℃過夜，空白對照組使用PBS作為一抗。過夜后PBS沖洗3遍，加二抗37 ℃放置30 min，DAB顯色試劑盒顯色2 min加蒸餾水終止，鏡下觀察。

1.2.2.2VEGFR-2檢測操作方法同上，一抗選擇兔抗人 VEGFR-2抗體(武漢博士德生物公司)。二抗選擇聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG，空白對照選擇PBS作為一抗，鏡下觀察。

1.3MTT法測定嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線取第2代細(xì)胞，均勻鋪入96孔板，每孔2×104個，加入EGM-2培養(yǎng)基200 μL，孵育24 h后換液。每日檢測1列8孔細(xì)胞。每日每孔加入MTT(5 mg/L)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加150 μL DMSO，震蕩10 min。使用酶標(biāo)儀(Thermo，美國)490 nm波長測每孔吸光度A，連續(xù)10 d。以時間為橫坐標(biāo)，平均吸光度A為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4異丙腎上腺素對細(xì)胞生長曲線的影響

1.4.1含異丙腎上腺素培養(yǎng)基的配制用EGM-2培養(yǎng)基稀釋異丙腎上腺素，配制濃度分別為5、10、20 mg/L及50、100、200 mg/L的含有異丙腎上腺素培養(yǎng)基備用。所有操作均在超凈臺內(nèi)完成。

1.4.2異丙腎上腺素對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響取第2代細(xì)胞消化離心并計(jì)數(shù)，然后均勻鋪入96孔板，每孔2×104個，加入EBM-2培養(yǎng)基200 μL，孵育24 h，細(xì)胞貼壁后換液，換為含有異丙腎上腺素的濃度分別為5、10、20 mg/L(低濃度組)及50、100、200 mg/L(高濃度組)的培養(yǎng)基，同時設(shè)空白EGM-2(不含異丙腎上腺素)為空白對照組。每組設(shè)4個復(fù)孔。放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h使用MTT法測定其吸光度，以時間為橫坐標(biāo)，平均吸光度為縱坐標(biāo)，分別做每個濃度的細(xì)胞生長曲線，并觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。使用多個相關(guān)樣本測量的非參數(shù)檢驗(yàn)比較每個濃度組及空白對照組吸光度的差異，統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS 17.0。

2結(jié)果

2.1血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)24 h后觀察，逐漸貼壁，呈類圓形至多角形。生長第2~3天后，數(shù)量逐漸增多。第4~5天細(xì)胞逐漸融合，呈多角形，但數(shù)量不超過50%。第8~9天，細(xì)胞逐漸成梭形及條索形，部分部位可見有類似血管結(jié)構(gòu)形成。細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上傳代(圖1、2)。

2.2血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞鑒定

2.2.1Ⅷ因子相關(guān)抗原(vwf)檢測使用免疫組化方法染色后顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多角形、梭形，胞漿著色呈棕黃色，細(xì)胞核未染色，呈陽性(圖3)。

2.2.2VEGFR-2檢測使用免疫組化方法染色后顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈多角形、梭形，胞漿著色呈棕黃色，細(xì)胞核未染色，呈陽性(圖4)。

2.3血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線的測定使用MTT法測定血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示第1~2天細(xì)胞吸光度平均值A(chǔ)增長緩慢，第3~5天迅速增長，第6天輕度下降，第7~8天再次上升達(dá)到平臺期，第9~10天逐漸下降(圖5)。

圖1血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

圖2血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞第2代

圖3Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化(DAB顯色×10倍)

圖4VEGFR-2免疫組織化學(xué)檢測(×10倍)

圖5　第2代血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線(MTT法)

2.4異丙腎上腺素對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的影響低濃度組各組24~72 h的吸光度值無明顯差異(P>0.05)，但在96 h時發(fā)現(xiàn)，低濃度組與空白對照組的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較后發(fā)現(xiàn)濃度越高，測得的吸光度值越高(P<0.05)，制作每組細(xì)胞吸光度的堆積折線圖(圖6)，顯示低濃度藥物對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞具有刺激作用，并且濃度越高，其刺激作用越強(qiáng)。與空白對照相比，高濃度組細(xì)胞的吸光度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩兩比較后各濃度組吸光度值各不相同，濃度越高所測得細(xì)胞的吸光度值越低，提示高濃度的藥物對細(xì)胞生長呈現(xiàn)抑制作用，并且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)(圖7)。

圖6　低濃度組異丙腎上腺素影響下血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞吸光度折線圖

圖7　高濃度組異丙腎上腺素影響下血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞吸光度折線圖

3討論

目前皮膚脈管組織腫瘤的命名很不一致，特別是血管組織腫瘤分類各不相同，迄今仍不十分滿意。1996年國際脈管性疾病研究學(xué)會將血管胎記分為兩大類：血管腫瘤和血管畸形[2]。血管腫瘤是以內(nèi)皮細(xì)胞增殖為特點(diǎn)，包括嬰兒血管瘤、晚發(fā)性化膿性肉芽腫以及其他發(fā)生在嬰幼兒期的罕見血管瘤，而血管畸形是血管形態(tài)發(fā)生中的異常。其好發(fā)于新生兒期，與嬰兒血管瘤不同，血管畸形在出生后第1年中不迅速增長也不自發(fā)消退。而國內(nèi)較為常用的是將皮膚血管瘤分為鮮紅斑痣、海綿狀血管瘤、草莓狀痣及混合型等等[3]。嬰幼兒血管瘤分為增生期、穩(wěn)定期、退化期。增生期一般是指從出生后開始，一般持續(xù)6～10個月，在此期間內(nèi)血管瘤不斷增生擴(kuò)展，迅速向周圍皮膚及深層組織侵犯。穩(wěn)定期一般持續(xù)3～6個月，此期內(nèi)血管瘤增長速度逐漸緩慢，隨著幼兒生長，血管瘤緩慢增長，但增長速度仍比小兒生長快，血管瘤增生和退化交替進(jìn)行。一般1歲以后血管瘤增長速度緩慢下來，部分毛細(xì)血管瘤開始退化，血管瘤內(nèi)纖維脂肪組織增多，毛細(xì)血管瘤顏色從紫紅色或深紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榈霞t色，以后顏色逐漸變淺退變?yōu)榛疑?，外形由飽滿隆起轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄街涟櫩s，皮膚組織纖維化。

本研究選擇增生期嬰兒血管瘤為研究對象，取手術(shù)切除標(biāo)本做血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)，使用LONZA公司(瑞典)的EGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。目前對于血管瘤發(fā)生機(jī)制的研究認(rèn)為生長因子對于血管瘤的形成起到非常重要的作用，例如血管內(nèi)皮生長因子及成纖維細(xì)胞生長因子、人胰島素樣生長因子等[4-6],而本研究培養(yǎng)基內(nèi)所含有的各種生長因子能夠選擇性促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長。因此在進(jìn)行血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)時除選材為增殖期的血管瘤標(biāo)本外，普通培養(yǎng)基不能滿足細(xì)胞生長的需要，而需要選擇含有特殊細(xì)胞因子的培養(yǎng)基。本研究行血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)后經(jīng)鑒定為血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞。

本研究所培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線的測定也呈現(xiàn)第1~2天緩慢，第3~5天迅速增長，第6天輕度下降，第7~8天再次上升達(dá)到平臺期，第9~10天逐漸下降，呈現(xiàn)雙峰。

2008年法國Bordeaux兒童醫(yī)院Léauté-Labrèze等[1]報(bào)道，在使用心得安治療1例伴有重癥血管瘤的心肌病和另1例伴血管瘤的心輸出量增加患兒時，意外地發(fā)現(xiàn)血管瘤萎縮變小。隨后心得安逐漸被醫(yī)生接受并廣泛用于血管瘤患兒，取得良好的療效, 異丙腎上腺素屬于β-受體拮抗劑，與心得安的作用相拮抗，因此β-腎上腺素受體的作用受到廣泛的關(guān)注。Ji等[7]報(bào)道異丙腎上腺素在體外能夠促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長。本研究針對異丙腎上腺素對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的作用展開了進(jìn)一步的研究，探討不同藥物濃度對于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞生長曲線的影響。結(jié)果顯示低濃度的異丙腎上腺素對增殖期嬰兒期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長呈現(xiàn)刺激作用，而高濃度(10倍)異丙腎上腺素對增殖期嬰兒期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長呈現(xiàn)抑制作用，提示異丙腎上腺素對增殖期嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的生長的影響受藥物濃度的影響。推測低濃度異丙腎上腺素對于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用體現(xiàn)了藥物本身通過β-腎上腺素受體的作用而對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的促進(jìn)作用，該結(jié)果與文獻(xiàn)[7]報(bào)道一致。而其與心得安的對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用互為拮抗，呈現(xiàn)鏡像關(guān)系，由此推測β-腎上腺素受體在嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，而高濃度的異丙腎上腺素對增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)的抑制作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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(本文編輯王艷)

通信作者：趙今，女，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，教授，研究方向：齲病學(xué)的防治研究,E-mail:merryljin@sina.com。