李　月，劉　戈，胡　佳

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001；2.上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，上海 201802；3.錦州市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 錦州 121000)

超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的工藝優(yōu)化

李月1，劉戈2，胡佳3

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 沈陽 110001；2.上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，上海 201802；3.錦州市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 錦州 121000)

摘要：以總黃酮提取率為考核指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的工藝條件，確定了最佳工藝條件為：提取溶劑為70%乙醇、固液比1∶35(g∶mL)、超聲波功率210 W、提取時(shí)間40 min，在此條件下，總黃酮平均提取率為8.0%，工藝穩(wěn)定性良好。與常規(guī)提取方法相比，超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮具有省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓葉；總黃酮；超聲波法；提取工藝

藍(lán)莓又稱越橘、藍(lán)漿果，屬杜鵑花科越橘屬植物。原產(chǎn)地為北美洲，我國主要分布在東北三省。藍(lán)莓果是營養(yǎng)豐富的水果和食用原料，同時(shí)藍(lán)莓葉也有很高的藥用價(jià)值。藍(lán)莓葉中含有較豐富的黃酮類成分，具有廣泛的生物活性[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，藍(lán)莓葉總黃酮具有抗氧化、抑制丙肝病毒復(fù)制、降低血糖等作用[1-3]。近年來，超聲波提取技術(shù)在中藥有效成分提取方面被廣泛應(yīng)用。超聲波提取過程無須加熱，減少了目標(biāo)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)改變。由于具有效率高、能耗低、污染少等特點(diǎn)[4]，超聲波提取技術(shù)更適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。作者采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬為后續(xù)中期實(shí)驗(yàn)及規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

1實(shí)驗(yàn)

1.1　材料、試劑與儀器

藍(lán)莓葉，2014年9月下旬采收于沈陽時(shí)圣藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)園。將藍(lán)莓葉置于干燥箱內(nèi)50 ℃烘干至恒質(zhì)量，用手提式粉碎機(jī)粉碎40 s，過60目篩，備用。

蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等均為分析純。

KH-400KDE型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；LD-200型手提式中藥粉碎機(jī)，長沙常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2　方法

1.2.1藍(lán)莓葉總黃酮的超聲波法提取

稱取干燥的藍(lán)莓葉粉末2.0 g，置于錐形瓶中，按一定的固液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，浸泡20 min，將錐形瓶置于超聲波提取儀內(nèi)，用一定功率的超聲波提取一定時(shí)間，將提取液4 000 r·min-1離心處理20 min，抽濾得上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑，濃縮，用石油醚萃取濃縮液，除去葉綠素，得到藍(lán)莓葉總黃酮樣品溶液。

1)單因素實(shí)驗(yàn)

分別改變乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)(40%～80%)、固液比(1∶15～1∶40，g∶mL，下同)、超聲波功率(90～240 W)和提取時(shí)間(10～50 min)進(jìn)行單因素多水平實(shí)驗(yàn)，考察以上因素對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響。

2)正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、固液比(B)、超聲波功率(C)、提取時(shí)間(D)為考察因素，以藍(lán)莓葉總黃酮的提取率為考核指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

1.2.2藍(lán)莓葉總黃酮提取率的測定

將超聲波提取的樣品溶液稀釋、定容，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色體系發(fā)生顯色反應(yīng)，用分光光度法在500 nm波長處測定吸光度。以蘆丁為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性方程為：A=9.836c+0.0017(R=0.9994)，線性范圍為5.6～56.0μg·mL-1。根據(jù)線性方程計(jì)算定容液中藍(lán)莓葉總黃酮的濃度，按下式計(jì)算藍(lán)莓葉總黃酮的提取率(F)：

表1　正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1　Factors and levels of orthogonal experiment

式中:c為定容液中總黃酮濃度，μg·mL-1；V為定容液的體積，mL；D為稀釋倍數(shù)；m為藍(lán)莓葉質(zhì)量，g。

1.2.3超聲波提取法與常規(guī)提取方法的對(duì)比

稱取4份干燥藍(lán)莓葉粉末各2.0 g,分別按照下列4種方法提取，比較藍(lán)莓葉總黃酮的提取率。

煎煮法：用沸水提取、固液比1∶50、每次提取40 min、提取3次。

乙醇回流法：以70%乙醇溶液為溶劑、固液比1∶40、70 ℃回流提取2 h。

索氏提取法：以70%乙醇溶液為溶劑、固液比1∶50、索氏提取3 h。

超聲波提取法：采用正交實(shí)驗(yàn)所確定的工藝條件。

2結(jié)果與討論

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的影響

室溫下，在固液比為1∶20、超聲波功率為120 W、提取時(shí)間為20 min的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見表2。

由表2可知，藍(lán)莓葉總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而先升高后降低。這是因?yàn)椋谝欢ǚ秶鷥?nèi)提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，能改善其對(duì)藍(lán)莓葉的浸潤、滲透，增大黃酮類成分的溶出度。若乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，部分脂溶性大的雜質(zhì)成分也被提取出來，黃酮類成分的提取率反而降低。此外，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，出膏率也相應(yīng)增多，為后期總黃酮的提純工作增加了難度。因此，選擇60%、70%和80%作為正交實(shí)驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)的3個(gè)水平。

表2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響/%Tab.2　The effect of ethanol volume fraction on　extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves　by ultrasonic method/%

2.1.2固液比對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的影響

其它條件同2.1.1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,考察固液比對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見表3。

表3　固液比對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Tab.3　The effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method

由表3可知，當(dāng)固液比不超過1∶35時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮的提取率隨溶劑用量的增大而提高。這是因?yàn)?，根?jù)Fick擴(kuò)散定律，當(dāng)溶劑用量增大時(shí)，超聲提取體系的體積增大，體系中總黃酮的濃度下降，其與固液邊界層的總黃酮濃度差加大，促使更多的黃酮類成分從物料中擴(kuò)散到溶劑中，提取率升高。當(dāng)溶劑量過大時(shí)，在超聲波功率一定的情況下，超聲波傳遞給單位體積溶劑的能量減少，提取率下降。因此，選擇1∶25、1∶30和1∶35作為正交實(shí)驗(yàn)中固液比的3個(gè)水平。

2.1.3超聲波功率對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的影響

其它條件同2.1.1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,考察超聲波功率對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見表4。

表4　超聲波功率對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Tab.4　The effect of ultrasonic power on extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method

由表4可知，當(dāng)超聲波功率低于180 W時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率隨超聲波功率的增大而提高。這是因?yàn)?，超聲波功率越大，超聲波輻射壓?qiáng)產(chǎn)生的空化作用、擾動(dòng)效應(yīng)、高加速度、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)就越強(qiáng)烈，物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度就越快，溶劑穿透力越強(qiáng)，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，提高了提取率[4]。當(dāng)超聲波功率超過一定限度時(shí)，由于超聲波能量過大，造成物料內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)坍塌，超聲波的空化等效應(yīng)下降[5]，提取率下降。因此，選擇150 W、180 W和210 W作為正交實(shí)驗(yàn)中超聲波功率的3個(gè)水平。

2.1.4提取時(shí)間對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的影響

其它條件同2.1.1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,考察提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響，結(jié)果見表5。

表5　提取時(shí)間對(duì)超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Tab.5　The effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method

由表5可知，提取時(shí)間在40 min內(nèi)，提取率隨提取時(shí)間的延長而提高；超過40 min以后，提取率有所下降。這可能是因?yàn)?，超聲波提取一段時(shí)間后，物料中的目標(biāo)成分已幾乎被提取完全，繼續(xù)延長提取時(shí)間，超聲波的熱效應(yīng)會(huì)使目標(biāo)成分加速分解，提取率下降。權(quán)衡提取率與能耗等因素，選擇20 min、30 min和40 min作為正交實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間的3個(gè)水平。

2.2　正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表6、方差分析見表7。

表6　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.6　Results and analysis of orthogonal experiment

表7　方差分析結(jié)果Tab.7　The results of variance analysis

注：F0.05(2，2)=19.00。

由表6、表7可知，4個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)?提取時(shí)間>超聲波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>固液比，4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率的影響均無顯著性差異。優(yōu)化的提取工藝條件為A2B3C3D3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、固液比為1∶35、超聲波功率為210 W、提取時(shí)間為40 min。按優(yōu)化工藝條件進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，得到藍(lán)莓葉總黃酮的平均提取率為8.0%，RSD為1.3%。說明所確定的超聲波法提取工藝條件的穩(wěn)定性良好。

2.3　超聲波提取法與常規(guī)提取法的比較(表8)

表8　超聲波提取法與常規(guī)提取法的比較Tab.8　Comparison of ultrasonic extraction method and conventional extraction method

由表8可知，超聲波提取法與3種常規(guī)提取方法相比，藍(lán)莓葉總黃酮的提取率較高，乙醇用量較少，而且大幅縮短了提取時(shí)間。因此，超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮具有提取效率高、成本較低、溶劑污染少的特點(diǎn)[6]。

3結(jié)論

以總黃酮提取率為考核指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮的工藝條件，確定最佳工藝條件為：提取溶劑為70%乙醇、固液比1∶35(g∶mL)、超聲波功率210 W、提取時(shí)間40 min，在此條件下，總黃酮平均提取率為8.0%，工藝穩(wěn)定性良好。與常規(guī)提取方法相比，超聲波法提取藍(lán)莓葉總黃酮具有省時(shí)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)勢。

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Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Blueberry

Leaves by Ultrasonic Method

LI Yue1,LIU Ge2,HU Jia3

(1.TheFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;

2.ShanghaiShyndecPharmaceuticalCo.,Ltd.,Shanghai201802,China;

3.JinzhouInstituteforFoodandDrugControl,Jinzhou121000,China)

Abstract：Using the yield of total flavonoids as evaluation index,the extraction process of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum conditions were determined as follows:70% ethanol as extraction solvent,solid-liquid ratio of 1∶35(g∶mL),ultrasonic power of 210 W,extraction time of 40 min.Under above conditions,the average extraction rate of total flavonoids was 8.0%.This process has good stability.Compared with the conventional extraction method,ultrasonic extraction method has advantages of time saving,low cost and environmental protection.

Keywords：blueberry leaves;total flavonoids;ultrasonic method;extraction process

中圖分類號(hào)：TQ 461

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2015)05-0048-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.012

收稿日期：2015-01-19

作者簡介：李月(1980-)，女，遼寧沈陽人，碩士，主管藥師，從事醫(yī)院藥學(xué)工作，E-mail:liyue1213@126.com。