張猛 單宏鵬 陳鋒 唐衛(wèi)中

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西南寧 530021）

在正常和癌變的結(jié)直腸黏膜上皮組織中ERβ是主要表達(dá)的雌激素受體，而ERα則是極少表達(dá)或不表達(dá)［1、2］。在結(jié)直腸組織癌變過程中 ERβ 選擇性表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌分化的惡性程度有相關(guān)性，因此ERβ可能在大腸癌變過程中起抑癌的保護(hù)性作用［3］。許多共調(diào)節(jié)因子蛋白的表達(dá)水平或活性的改變會(huì)導(dǎo)致ER信號分子的改變［4、5］。特別是共激活因子的過表達(dá)和下調(diào)共抑制因子可使內(nèi)分泌治療的抑制作用無效，尤其是在應(yīng)用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）例如他莫昔芬（tamoxifen）［6］。因此進(jìn)一步開展雌激素受體共調(diào)節(jié)因子在結(jié)直腸中的作用的研究對CRC的激素替代治療和針對ERβ分子的靶向治療顯得至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)主要研究雌激素受體共激活因子其中之一AIB1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)以及與臨床資料間的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 材料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年03月至2014年11月行結(jié)直腸癌切除術(shù)的結(jié)直腸癌及其配對正常組織標(biāo)本200例，其中男性119例，女性89例，平均年齡55．6歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌的病例。排除標(biāo)準(zhǔn)：無足夠的標(biāo)本量，無詳細(xì)臨床資料記錄，患有兩個(gè)及其以上的原發(fā)性癌癥、患者術(shù)前進(jìn)行抗癌治療尤其是雌激素替代治療的病例排除。配對正常組織術(shù)后病理證實(shí)為正常大腸組織?；颊吲R床資料包括：年齡、性別、民族、腫瘤位置、腫瘤大小、大體病理類型、分化程度、病理分期、有無神經(jīng)官侵犯、有無血管侵犯、TNM分期。本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本采集均經(jīng)過患者本人知情同意且經(jīng)過廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)所有過程依照赫爾辛基宣言（Helsinki Declaration）進(jìn)行。120例預(yù)備進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測的標(biāo)本按照標(biāo)準(zhǔn)浸泡入10%的福爾馬林溶液中。80例預(yù)備進(jìn)行熒光定量PCR的新鮮組織放入液氮中速凍15 min后小心移入-80°C超低溫冰箱中暫時(shí)儲存。

1．2 方法

1．2．1 總RNA的制備和逆轉(zhuǎn)錄PCR 根據(jù)使用說明書從80例新鮮組織中提取總RNA（total RNA）應(yīng)用總RNA提取試劑盒 （Cat＃12113KD1，AXYGEN，蘇州，中國）。隨即，應(yīng)用NANODROP2000型核酸檢測儀（Thermo Scientific， CA， USA）通過 A260／A280比值計(jì)算total RNA的純度。根據(jù)使用說明書應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （Roche Diagnostics，Mannhelm，德國）將total RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（Complementary DNA）。20μL逆轉(zhuǎn)錄體系在 ABI GeneAmp PCR System 9700 PCR 儀（Applied Biosystems， 新加坡）的反 應(yīng) 條 件 如 下 ：65°C 10 min、4°C 3 min、25°C 10 min、55°C 30 min、85°C 5 min。 將 cDNA 置于-20°C暫時(shí)儲存。

1．2．2 熒光定量PCR（RT-qPCR） 根據(jù)使用說明應(yīng)用 Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche Diagnostics，Mannhelm，德國）進(jìn)行熒光定量 PCR（RT-qPCR），在 ABI Step-one PlusTM Realtime PCR System型熒光定量 PCR儀 （Applied Biosystems， 新加坡）的反應(yīng)條件如下：95°C 10 min、95°C 15s、60°C 1 min 40 個(gè)循環(huán)。熒光定量 PCR 的內(nèi)參為beta-actin以及陰性反應(yīng)為排除cDNA的PCR反應(yīng)。靶基因的引物序列為：AIB15’-GGTGCAGCTGAAAGTAAACAGAATG-3’ （forward） 和5’ -TCGTTTATTAACAGTGTGCCTTGGA-3’ （reverse），beta-actin 5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’ （forward） 和 5’ -CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’ （reverse），所有引物均合成于Takara大連公司。應(yīng)用等比例稀釋法做標(biāo)準(zhǔn)曲線。每一個(gè)樣本均重復(fù)三次來增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。靶基因的表達(dá)量的確定是參照內(nèi)參表達(dá)量應(yīng)用2-ΔCt公式計(jì)算。最后根據(jù)ROC曲線的CUTOFF值將靶基因mRNA表達(dá)量分為兩組：低表達(dá)組，高表達(dá)組。

1．2．3 免疫組化（IHC） 將80對應(yīng)用于免疫組化的癌和正常配對組織從福爾馬林中拿出后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片（4微米厚），然后在按比例稀釋的酒精中依次脫蠟，后在檸檬酸修復(fù)液（pH=6．0）中高壓修復(fù)抗原。然后應(yīng)用免疫組化三步法試劑盒（ZSGB-bio，北京，中國）進(jìn)行一下實(shí)驗(yàn)步驟：3%H2O2室溫孵育 10～15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性、1%山羊血清室溫孵育15～20 min封閉抗原、一抗（AIB1抗兔多克隆抗體、1：1600， bs-2919R，Bioss，北京，中國）4°C 孵育過夜、抗鼠 ／兔二抗 37°C 孵育 15～20 min、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37°C孵育15～20 min。隨即進(jìn)行DAB染色（ZLI-9017，ZSGB-bio，北京，中國），蘇木素復(fù)染50s。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，人類乳腺癌作為陽性標(biāo)準(zhǔn)。一抗稀釋液代替一抗蛋白孵育作為陰性對照。

1．2．4 免疫組化結(jié)果判斷 在單盲情況下每張切片均由兩位病理醫(yī)生獨(dú)立判片。細(xì)胞質(zhì)和／或細(xì)胞核呈棕黃色顆粒樣物質(zhì)判讀為陽性表達(dá)。著色評分是根據(jù)著色深度分為三級：0分無著色、1分為淡黃色或著色模糊、2分為棕黃色、3分為深棕色。在6個(gè)不同400倍視野下分別計(jì)算總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)求得陽性率，然后乘以該視野的著色評分，最后求6六個(gè)視野平均值為靶蛋白在該切片上的陽性表達(dá) （0～300）以備后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)陽性表達(dá)的ROC曲線的cutoff值來確定陰陽性率，高于cutoff值為陽性，反之為陰性。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均完成于SPSS 16．0 software （SPSS， Chicago， IL， 美國）。癌和配對正常組織組間靶基因／蛋白的差異表達(dá)用Student’s t test統(tǒng)計(jì)。靶基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)與病例臨床資料之間關(guān)系用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法統(tǒng)計(jì)。所有統(tǒng)計(jì)P值小于0．05的情況下認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 AIB1mRNA的表達(dá)量與臨床、病例指標(biāo)之間的關(guān)系

表2 AIB1蛋白表達(dá)量與臨床、病例指標(biāo)之間的關(guān)系

2結(jié) 果

2．1 AIB1 在結(jié)直腸癌中的表達(dá) 熒光定量PCR確定了AIB1在80例CRC組織和配對正常黏膜上皮組織中的mRNA水平表達(dá)。與正常組織相比，AIB1在CRC中表達(dá)顯著降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．001）見圖1。根據(jù)120對結(jié)直腸癌病例的免疫組化

圖1 AIB1在結(jié)直腸癌組織和配對正常組織中mRNA的相對表達(dá)量，柱狀圖表示的是均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，相對表達(dá)量的參照標(biāo)準(zhǔn)是 β-ACTIN，Student＇s，檢驗(yàn)結(jié)果是 t=3．938,P ＜0．001

結(jié)果最終確定了AIB1的蛋白水平表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示在癌和正常組織中AIB1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有著色且主要著色于細(xì)胞質(zhì)。此外，陽性表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致。AIB1在癌和正常組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20．741， P ＜0．001），其陽性率分別為29．2% 和58．3%，見圖2。

2．2 AIB1在CRC中的診斷價(jià)值 在檢測癌組織中AIB1在mRNA水平和蛋白水平上表達(dá)的同時(shí)，我們做了ROC曲線判斷AIB1在結(jié)直腸癌中的診斷價(jià)值。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)AIB1在CRC發(fā)生發(fā)展過程中有診 斷預(yù)測價(jià) 值 ， 其 AUC 值 為 0．709 （CI：0．620～0．798， P ＜0．001），cutoff值為 0．379，見圖 3。

2．3 AIB1與 CRC臨床資料的關(guān)系 根據(jù) RT-qPCR的結(jié)果，以下結(jié)論為AIB1mRNA表達(dá)與臨床資料的關(guān)系。AIB1的相對表達(dá)量僅與腫瘤的大小有關(guān)（χ2=5．208， P=0．022），與其他的臨床資料關(guān)系均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0．05）。 同時(shí)，根據(jù) Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)兩者存在正相關(guān)（r=0．255， P=0．022），即

圖 2 A在癌組織中的中AIB1主要著色于癌細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（×400）。B在正常組織中AIB1的主要著色于黏膜上皮細(xì)胞、腸腺細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞（×400）。

圖3 ROC曲線來評價(jià)AIB1在結(jié)直腸癌中的診斷預(yù)測 價(jià) 值 ，AIB1 的 AUC 值 是 0．709 （CI：0．620～0．798， P ＜0．001）。

腫瘤越大AIB1的表達(dá)量越高見表1。根據(jù)免疫組化的結(jié)果我們同樣得出蛋白水平的表達(dá)量與臨床資料的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)與無脈管侵犯相比，CRC存在脈管侵犯時(shí) AIB1 表達(dá)下降（χ2=9．431， P=0，002），且兩者的負(fù)相關(guān)關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0．223，P=0．015）。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)AIB1的表達(dá)也與T分期有關(guān)（χ2=6．272， P=0．043），但兩者的線性關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （r=-0．178， P=0．052）。 與之相反的是AIB1與TNM分期存在正相關(guān)關(guān)系，即癌癥分期越晚 AIB1 表達(dá)越高 （χ2=622．95， P ＜0．001， r=0．31，P=0．001），見表 2。

3討 論

共激活因子SRC家族是雌激素受體轉(zhuǎn)錄共激活因子P160超家族的成員。SRC包括核受體在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)錄因子。該家族的成員有共同的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)可能在調(diào)控ER活性上有重要作用［7］。在ER依賴的基因轉(zhuǎn)錄中SRC共激活因子在細(xì)胞中過表達(dá)可增強(qiáng)SERMs興奮活性。當(dāng)配體高表達(dá)時(shí)，該家族成員蛋白可明顯增加激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄且此過程由核受 體 介 導(dǎo) 包 括 ER、PR （progesterone receptor）、TR（thyroid receptor）、GR（glucocorticoid receptor）、RAR（retinoic acid receptor）。

AIB1（amplification in breast cancer1）是 SRC 家族中第三位成員也被稱為 SRC-3、PAC3、ACTR、NCoA3，該因子是在乳腺癌中首先被發(fā)現(xiàn)。AIB1基因位于染色體20q12，AIB1的活性影響增值過程。在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中AIB1基因大量擴(kuò)增和高表達(dá)。在其他器官惡性腫瘤中比如卵巢、子宮內(nèi)膜、胃、肝臟和前列腺中也存在AIB1高表達(dá)或擴(kuò)增的現(xiàn)象。

流行病學(xué)、病理學(xué)、分子生物學(xué)均證實(shí)雌激素受體（ER）尤其是ERβ在結(jié)直腸組織癌變過程中起抑癌的保護(hù)性作用［2、3、8］。 經(jīng)典雌激素受體一配體依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路認(rèn)為，雌激素受體ER和雌激素結(jié)合形成激素-受體復(fù)合物后隨即發(fā)生構(gòu)型的改變活化自身形成二聚體并具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，之后募集一些共調(diào)節(jié)因子與雌激素受體反應(yīng)元件ERE結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。因此AIB1作為雌激素受體轉(zhuǎn)錄共激活因子，在結(jié)直腸癌中應(yīng)該具有和ERβ相似的生物學(xué)效應(yīng)，即抑癌的保護(hù)性作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無論是mRNA水平還是蛋白水平AIB1在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低。因此，AIB1可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中并在其中起抑制作用，然而這一推論卻與先前文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致。用免疫組化檢測110名CRC患者的AIB1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)與正常黏膜相比，AIB1在癌組織中的表達(dá)量顯著升高［9］。同時(shí)發(fā)現(xiàn)從正常黏膜組織到腺瘤最后到腺癌這一過程AIB1蛋白表達(dá)逐漸升高［10］。從以往的研究可以推測出AIB1在CRC發(fā)展過程中起一個(gè)促進(jìn)因子的作用。然而這些研究僅限于蛋白水平的檢測，本實(shí)驗(yàn)在更多病例數(shù)中對同一靶基因同時(shí)檢測了mRNA和蛋白水平的表達(dá)，且兩者是一致的結(jié)果。關(guān)于AIB1在結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中的具體作用和通路仍需要更多的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

免疫組化中AIB1著色部位的變化反映了特定組織類型對類固醇激素的不同反應(yīng)。AIB1是核受體的調(diào)節(jié)因子主要著色部位為細(xì)胞核。在乳腺癌中AIB1陽性反應(yīng)位于細(xì)胞核［11］。然而，在甲狀腺乳頭狀癌組織中，AIB1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均有著色［12］。本實(shí)驗(yàn)中，AIB1在CRC組織中胞質(zhì)和胞核均有著色，且主要在胞質(zhì)中。但是AIB1在結(jié)直腸癌中的陽性反應(yīng)部位仍有爭論。Petros D等［9］發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中的中AIB1主要著色于黏膜上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，炎癥細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核。Vassiliki Tzelepi等［10］也得出了類似結(jié)論。著色部位在某些程度上也同時(shí)受到一抗影響，例如，Nicole N Balmer等［13］發(fā)現(xiàn)在免疫組化中用兩種不同克隆體系的AIB1得到不同的AIB1蛋白表達(dá)類型，將AIB1（BD）一抗應(yīng)用于子宮內(nèi)膜癌得到核表達(dá)，AIB1（SC）一抗得到胞質(zhì)陽性。因此不同克隆體系的一抗可能產(chǎn)生不一致的陽性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的陽性反應(yīng)主要在胞漿說明與傳統(tǒng)的乳腺癌中參與細(xì)胞核受體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)不同，AIB1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中可能更多地參與細(xì)胞質(zhì)中的信號傳導(dǎo)。這至少部分證明了AIB1在不同癌癥尤其是乳腺癌和結(jié)直腸癌中發(fā)揮不同生物學(xué)效應(yīng)。

從以上AIB1在癌與正常組織中的表達(dá)類型可以推測出AIB1在CRC發(fā)生發(fā)展過程中起抑癌作用，分析AIB1與臨床資料之間的關(guān)系也部分印證了該假設(shè)。結(jié)直腸癌出現(xiàn)脈管侵犯時(shí)AIB1蛋白表達(dá)降低，這說明AIB1表達(dá)的減少可能使得癌細(xì)胞的侵襲力增大。AIB1與T分期的關(guān)系也印證了這一點(diǎn)，雖然AIB1與T分期無直接的負(fù)性線性關(guān)系，但是從陽性率上依然可以看到T2期AIB1蛋白表達(dá)最高（37.3%），T4期AIB1陽性率最低（0%）。 T分期反應(yīng)的是腫瘤侵襲的范圍和深度，直接影響到治療方式和預(yù)后情況，AIB1與T分期的關(guān)系這說明AIB1表達(dá)量可能影響到腫瘤的進(jìn)展，并起一定的抑制作用。但是在此過程中出現(xiàn)一些不一致的結(jié)論，同樣在蛋白水平AIB1的表達(dá)量與TNM分期程正相關(guān)，即臨床分期越晚AIB1的表達(dá)量越高，這與之前截然相反的結(jié)論說明AIB1在結(jié)直腸癌中參與的通路非常復(fù)雜，而所表現(xiàn)出來的生物學(xué)效應(yīng)也不是簡單的單一模式。AIB1在CRC中可能同時(shí)參與促癌和抑癌兩種通路，在不同個(gè)體結(jié)直腸癌進(jìn)展過程中由不同因子激活這兩種通路。這一假設(shè)也在其他研究中得到佐證。一項(xiàng)對85名結(jié)直腸癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，較晚的臨床分期更易出現(xiàn)AIB1的過表達(dá)，這表明AIB1的過表達(dá)可能在CRC發(fā)生發(fā)展過程中有選擇性促進(jìn)作用［14］。AIB1可抑制CRC細(xì)胞系的細(xì)胞周期使其處于G1期，從而抑制其增殖［15］。在mRNA水平上我們發(fā)現(xiàn)AIB1僅與腫瘤大小呈正相關(guān)，AIB1在mRNA水平和蛋白水平不一致的結(jié)果說明AIB1靶基因可能參與在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中尤其是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)通路。但是從總體看mRNA和蛋白表達(dá)均在癌中降低，說明轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程對最終起生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)影響不大。

通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果我們認(rèn)為AIB1可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，并在這一過程中起一定的抑癌的保護(hù)作用，但是這一過程非常復(fù)雜。在結(jié)直腸癌變過程中，AIB1可能重新參加了新的分子通路，使得其在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)增高，這些分子通路的綜合生物學(xué)效應(yīng)可能促進(jìn)亦可能抑制癌癥的進(jìn)展。證明AIB1在CRC中的具體作用機(jī)制需要更多更深入的研究。

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