周小鋒， 何 藝， 童國(guó)通

（杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨江學(xué)院，浙江 杭州 310018）

環(huán)境內(nèi)分泌干擾素也稱為環(huán)境激素，是指外因性干擾生物體內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，它可使生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)，進(jìn)而影響生殖發(fā)育機(jī)能，并存在引發(fā)惡性腫瘤及生物種群退化滅絕的可能，因而環(huán)境激素已成為所有生物的天敵［1-3］。烷基酚中的辛基苯酚（OP）在美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）1997年提出的70種環(huán)境激素中榜上有名，它是辛基酚聚氧乙烯醚（OPEO）的代謝產(chǎn)物［4-5］。OPEO作為質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的非離子表面活性劑曾被大量生產(chǎn)和使用，導(dǎo)致其在自然界普遍存在而成為人類的潛在殺手之一。因此，對(duì)環(huán)境樣品中烷基酚（OP）的檢測(cè)及生態(tài)修復(fù)已刻不容緩。

本研究基于超臨界技術(shù)（SFE）-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）開展對(duì)環(huán)境樣品中環(huán)境激素烷基酚（AP）的檢測(cè)方法研究。環(huán)境激素在環(huán)境中廣泛存在，基體復(fù)雜、含量低但危害極大，烷基酚也不例外。對(duì)于環(huán)境樣品中微量物質(zhì)的分析，樣品前處理往往是決定檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。研究高效、簡(jiǎn)便的樣品提取、濃縮、凈化的前處理技術(shù)成為環(huán)境激素檢測(cè)方法建立首先要解決的課題［6-9］。

二氧化碳超臨界流體萃取（SFE-CO2）是非溶劑提取技術(shù)。本文以二氧化碳超臨界萃取法（SFECO2）作為環(huán)境樣品前處理方法，研究表明，用SFE技術(shù)對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行預(yù)處理具有提取效率高、耗時(shí)短、且不需使用有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)［10］。

在環(huán)境樣品（如土壤或農(nóng)產(chǎn)品）中除含有極少量的檢測(cè)目標(biāo)物（環(huán)境激素AP）外，還含有大量各種可能干擾分析檢測(cè)的物質(zhì)。為了減少干擾，提高檢測(cè)的靈敏度，樣品須經(jīng)過必要的預(yù)處理之后才可用儀器（GC/MS）檢測(cè)。因此，環(huán)境樣品前處理研究是烷基酚（AP）檢測(cè)方法研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬重點(diǎn)進(jìn)行環(huán)境樣品中烷基酚提取的超臨界萃取條件優(yōu)化研究，采用正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)的萃取溫度、萃取壓力、靜態(tài)萃取時(shí)間、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間等二氧化碳超臨界萃取工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器

二氧化碳超臨界萃取儀，美國(guó)Applied Separations，SFE-2；7890GC-5975CMSD，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.1.2 儀器工作條件

二氧化碳超臨界萃取條件：萃取溫度與壓力控制在在二氧化碳臨界溫度（31.06℃）與臨界壓力（7.14MPa）以上。通過單因素使用及正交實(shí)驗(yàn)獲得最佳萃取工藝條件。

GC條件：色譜柱為 HP-5，5%phenyl methyl siloxane，19091J-433（30m×250μm×0.25μm）；載氣為高純氦氣，進(jìn)樣口溫度為250℃；程序升溫：初始70℃，保持2min，然后以20℃/min升至240℃，再以3℃/min升至300℃，并保持2min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積2.0μL。

MS條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃；EI源，電子轟擊能量70eV；溶劑延遲3min；全掃描范圍25m/z～550m/z。

1.1.3 試劑

對(duì)特辛基苯酚（OP），標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉??；乙酸乙酯，色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；二甲基亞砜，A.R.，無錫海碩生物有限公司；六甲基二硅胺烷，A.R.，98.0%，阿拉??；三甲基氯硅烷，A.R.98.0%，阿拉丁。

OP標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯配成1.00mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于0℃以下保存，臨用前用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋配制成OP標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.1.4 空白土樣及標(biāo)準(zhǔn)土樣

空白土樣制備：取適量經(jīng)干燥、粉碎、過篩、混勻的土樣若干份，分別裝入萃取釜，在待萃取條件下進(jìn)行充分萃取處理后備用。

標(biāo)準(zhǔn)土樣（模擬土樣）的制備：準(zhǔn)確稱取適量空白土樣加入準(zhǔn)確量的辛基酚標(biāo)準(zhǔn)使用液，混合均勻，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超臨界萃取劑及萃取物的檢測(cè)

土樣的二氧化碳超臨界萃?。簩?zhǔn)確量的標(biāo)準(zhǔn)土樣（模擬土樣）裝入萃取釜，將萃取溫度、萃取壓力控制在二氧化碳超臨界條件（31.06℃、7.14MPa）以上，將二氧化碳超臨界流體通入萃取釜，進(jìn)行靜態(tài)萃取一定時(shí)間，打開接收閥并調(diào)節(jié)固定的超臨界流體流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)萃取一定時(shí)間，用接收瓶持續(xù)接收萃取物。

萃取物中辛基酚的GC/MS檢測(cè)：用乙酸乙酯溶解、轉(zhuǎn)移、定容萃取物，通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）檢測(cè)萃取物中辛基酚（OP），計(jì)算萃取率。GC/MS檢測(cè)土樣萃取物中OP的總離子流圖（TIC）如圖1，GC/MS檢測(cè)土樣萃取物中辛基酚（OP）的質(zhì)譜圖如圖2。

1.2.2 二氧化碳超臨界萃取工藝優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)法確定二氧化碳超臨界萃取的優(yōu)化工藝條件。以辛基酚（OP）萃取率為考查指標(biāo)，以萃取溫度A（℃）、萃取壓力B（MPa）、靜態(tài)萃取時(shí)間C（min）、動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間D（min）為考查變量，借助正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1進(jìn)行五因素四水平L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1統(tǒng)計(jì)分析的直觀分析和方差分析進(jìn)行顯著性判定，從而快速建立相對(duì)優(yōu)化的土壤中OP檢測(cè)分析的SFE-CO2超臨界提取的前處理工藝。

圖1 GC/MS檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)土樣萃取物的總離子流圖

圖2 GC/MS檢測(cè)土樣萃取物的辛基酚質(zhì)譜圖

運(yùn)用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），共需進(jìn)行16項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)數(shù)據(jù)處理后獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的均值輸入正交設(shè)計(jì)助手Ⅱv3.1軟件進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)的直觀分析及方差分析。

表1 超臨界萃取工藝優(yōu)化因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，見表2和表3。

表2 超臨界萃取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀分析

表3 超臨界萃取工藝正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

通過正交實(shí)驗(yàn)的直觀分析和方差分析表，我們進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：

主次因子分析：從直觀分析表（表2）中各因素的極差項(xiàng)R分析及通過方表分析表（表3）方差分析進(jìn)行顯著性判定，可以看出，實(shí)驗(yàn)因子A、B、C、D對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有不同影響，其中，實(shí)驗(yàn)因子C（靜態(tài)萃取時(shí)間）對(duì)萃取率的影響最為明顯，其他因子的影響大小依次為：D（動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間）＞A（萃取溫度）＞B（萃取壓力）。

優(yōu)化水平分析：通過表2可以看出，在各實(shí)驗(yàn)因子中，A（萃取溫度）以水平2為最優(yōu)，B（萃取壓力）以水平3為最優(yōu)，C（靜態(tài)萃取時(shí)間）以水平4為最優(yōu)，D（動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間）以水平4為最優(yōu)。因此，A2B3C4D4是優(yōu)化的超臨界萃取工藝條件。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，靜態(tài)萃取時(shí)間C3（30min）與C4（60min）萃取率（均值）比較接近，表明物料中的辛基酚在二氧化碳超臨界流體中經(jīng)過30min的“浸泡”已基本浸出，在實(shí)際工作中，選用A2B3C3D4作為萃取條件獲得的萃取率也比較理想，同時(shí)較A2B3C4D4大大提高了時(shí)間效率。所以，在實(shí)際檢測(cè)中A2B3C3D4的萃取條件也可酌情選用。

2.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

對(duì)優(yōu)選萃取條件A2B3C4D4進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為89.07%、89.83%、87.28%，平均結(jié)果為88.73%，結(jié)果滿意。驗(yàn)證了A2B3C4D4為本研究的優(yōu)化超臨界萃取（前處理）工藝條件，即優(yōu)化萃取溫度45℃，萃取壓力30MPa，靜態(tài)萃取時(shí)間60min，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間90min。在優(yōu)化條件下對(duì)土壤樣品中微量辛基酚的提取率可以達(dá)到88%以上。

3 結(jié)論

研究表明，用二氧化碳超臨界萃取法（SFE）作為環(huán)境樣品中微量環(huán)境激素辛基酚GC/MS檢測(cè)的前處理方法是可行的，該前處理方法操作簡(jiǎn)單，提取效率高，其萃取方法不需要消耗有機(jī)溶劑，是一種環(huán)境友好的提取手段。以正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化了二氧化碳超臨界萃取法提取土壤中微量辛基酚的工藝條件，優(yōu)化萃取溫度45℃，萃取壓力30MPa，靜態(tài)萃取時(shí)間60min，動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間90min。在優(yōu)化條件下對(duì)土壤樣品中微量辛基酚的提取率可以達(dá)到88%以上。本研究為環(huán)境樣品（土壤、植物）中微量環(huán)境激素辛基酚（OP）的GC/MS分析檢測(cè)提供了有效的樣品前處理方法，也為環(huán)境樣品中其他微量環(huán)境激素的檢測(cè)及其他樣品（紡織品、食品等）中烷基酚的檢測(cè)的前處理提供借鑒，是進(jìn)一步有效檢測(cè)環(huán)境激素從而合理規(guī)避環(huán)境激素危害及控制環(huán)境環(huán)境激素污染的前提。

［1］ Lu L L，Snell T W，Yang J X，et al.Effects of fenitrothion on life history parameters of the rotifer Brachionus calyciflorus［J］.Journal of Fresh water Ecology，2010，25：589-598.

［2］ Balaram K A，Siva Rava R T，Sreedhar Bojja.Photocatalytic degradation of monocrotophos pesticide-an endo-crine disruptor by magnesium doped titania［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，186：1234-1240.

［3］ Wang Y，Hu W，Cao Z，et al.Occurrence of endocrine disrupting compounds in reclaimed water from Tianjin，China［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2005，383（5）：857-863.

［4］ 程燕，譚麗超，王蕾，等.國(guó)外環(huán)境激素類農(nóng)藥優(yōu)先名錄篩選研究［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2014，35（4）：28-35.

［5］ 裴鈺鑫.水中典型內(nèi)分泌干擾素的分析方法及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)研究［D］.南京：南京理工大學(xué)，2013.

［6］ 常薇，郁翠花，周娟.單液滴薇萃取-氣相色譜/質(zhì)譜法檢測(cè)水中多環(huán)芳烴［J］.環(huán)境污染與防治，2009，31（5）：54-56.

［7］ 嚴(yán)龍，盧鴦，郭偉強(qiáng).固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜-選擇離子法測(cè)定紡織助劑中壬基酚［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2010，37（6）：675-679.

［8］ 張鶴小.固相微萃取高效液相色譜法測(cè)定工業(yè)污水中酚類環(huán)境激素［D］.沈陽：沈陽師范大學(xué)，2013.

［9］ Gathitu B B，Chen W Y，Mcclure M.Effects of coal interaction with supercritical CO2：physical structure［J］.Industrial and Engineering Chemistry Research，2009，48：5024-5034.

［10］劉同舉，杜志國(guó)，郭瑩.超臨界流體技術(shù)在石油化工中的應(yīng)用［J］.化工進(jìn)展，2011，30（8）：1678-1680.