一對2型糖尿病老年雙生子基因表達譜動態(tài)變化比較

譚從娥馮文哲1王米渠2

(陜西中醫(yī)學院中醫(yī)診斷學教研室，陜西咸陽712046)

摘要〔〕目的分析一對老年同卵雙生子2型糖尿病(T2DM)隨病程延長而穩(wěn)定表達的基因功能特征。方法連續(xù)2年分6次調(diào)查一對老年雙生子的T2DM病情變化并作基因芯片實驗，篩選出表達量隨病程延長而連續(xù)升高的基因為雙生子的共表達基因，通過FatiGO Compare工具比較兩組共表達基因功能注釋的異同。結(jié)果分別篩選到大、小雙的共表達基因473和529個，其中相同的共表達基因功能富集于“T細胞活化調(diào)節(jié)” 基因本體(GO)類，不同的共表達基因功能差異體現(xiàn)在分子功能調(diào)節(jié)及刺激反應2個GO類別。結(jié)論免疫功能基因的異常表達是該對雙生子T2DM隨病程延長而穩(wěn)定出現(xiàn)的共性特征。

關(guān)鍵詞〔〕2型糖尿病；同卵雙生子；共表達基因；基因表達譜

中圖分類號〔〕R587.1〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81473559)；陜西省自然科學基礎研究計劃(No.2011JM4024)

1陜西中醫(yī)學院附屬醫(yī)院2成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院

第一作者：譚從娥(1972-)，女，副教授，博士，主要從事證侯的分子調(diào)控機制研究。

同卵雙生子間一致的表征可認為與遺傳因素有關(guān)，不一致的表征則大多數(shù)與環(huán)境因素有關(guān)〔1〕?；虻谋磉_會受到時空因素的影響，不同的外在環(huán)境會導致基因的表達量不同，本研究分析2型糖尿病(T2DM)同卵雙生子功能基因表達的異同，探討雙生子T2DM隨時間延長而穩(wěn)定表達的功能基因特征。

1對象與方法

1.1對象雙生子，女性，69歲，均出生并居住于四川省成都市。根據(jù)世界衛(wèi)生組織1999頒布的糖尿病診斷標準，雙生子均為T2DM患者。大雙病史7年，小雙病史9年。理化檢查提示大、小雙目前無明顯的糖尿病并發(fā)癥。采用微衛(wèi)星DNA基因分型技術(shù)〔2，3〕鑒定雙生子卵型(同卵或異卵)，結(jié)果雙生子的15個基因座完全相同，說明這對雙生子為同卵雙生子。實驗前均簽署知情同意書。

1.2理化檢查于2011年1月至2012年8月內(nèi)，每4個月一次完成雙生子T2DM患者全身體檢，每年3次，共6次。雙生子體檢于成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院體檢中心完成，項目包括一般情況、物理檢測、生化常規(guī)及糖化血紅蛋白等內(nèi)容。每次采取外周血以備完成基因芯片實驗。

1.3基因芯片實驗方法以大雙和小雙為實驗組，以大雙的女兒為正常對照，每4個月一次共6次采取雙生子外周血，基因芯片實驗于上海生物芯片有限公司完成。實驗流程：取實驗組和正常對照每人外周血10 ml，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用上海生物芯片有限公司制備的cDNA人類全基因組表達譜芯片，實驗組和對照分別用cy3和cy5標記，進行基因芯片雜交。芯片用ScanArray Express雙通道激光掃描儀(Packard Bioscience公司)掃描，軟件讀取數(shù)據(jù)，采用Genespring進行Normalize處理分析，最后ratio值為實驗/對照。

1.4基因芯片數(shù)據(jù)分析共表達基因的篩選標準為6次檢測的差異基因中表達量連續(xù)升高的基因。采用FatiGO Compare數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)雙生子之間共表達基因的GO和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路注釋比較。

1.5統(tǒng)計學分析組間比較行Fisher精確檢驗。

2結(jié)果

2.1雙生子實驗室檢測結(jié)果雙生子但T2DM病情的輕重程度差異較大，小雙重于大雙。大雙糖化血紅蛋白值介于6.0%～8.0%之間，血糖控制較為理想，小雙糖化血紅蛋白值在8.0%～9.0%之間，說明對血糖的控制較差。小雙的甘油三酯輕度升高，而且在2011年5月的體檢中發(fā)現(xiàn)血尿素氮(BUN)增高，大雙在3次體檢中這兩項指標正常，提示大雙和小雙目前均無嚴重的肝腎功能損害。見表1。

2.2雙生子共表達基因篩選結(jié)果根據(jù)共表達基因的篩選標準得到大雙共表達基因473個，小雙共表達基因529個，兩組共表達基因中相同的為15個，大電導鈣激活鉀通道，M亞族β鏈成員4(KCNM)、Lysosomal相關(guān)的膜蛋白(LAMP)3、白介素(IL)-18、核孔蛋白210 kD(NUP210)、IL-12A、聚合酶(POLE4)、IL-1R1、環(huán)指蛋白(RNF)122、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)4、溶質(zhì)攜帶物家族38，成員(SLC38A)1、載脂蛋白L域含1(APOLD1)、早期反應(IER)5、人白細胞抗原(HLA-DPA)1、賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(KDM)3A、人鳥苷酸核苷酸結(jié)合蛋白(GBP)4。

表1雙生子3年血生化及糖化血紅蛋白檢查結(jié)果(大雙/小雙)

2010-6-252011-6-72012-4-26空腹血糖7.35/13.68.09/13.7217.8/18.40餐后2h血糖9.90/16.7211.26/13.4210.54/18.74甘油三酯1.38/2.251.36/3.541.12/2.74血尿素氮(mmol/L)4.33/5.423.91/8.165.12/6.46糖化血紅蛋白(%)6.90/8.607.60/9.507.60/8.90

2.2.1雙生子相同的共表達基因功能注釋將相同的15個基因輸入FuncAssociate芯片數(shù)據(jù)網(wǎng)絡分析平臺，結(jié)果基因功能注釋只有1個顯著性GO類(P<0.05)，即T細胞活化的調(diào)節(jié)，有3個基因(IL-18、IL-12A、IRF4)被注釋到該GO術(shù)語。KEGG通路注釋發(fā)現(xiàn)，15個基因被注釋到19條分子通路，其中細胞因子-細胞因子受體相互作用通路具有顯著性，3個基因IL-18、IL-12A、IL-1R1在該通路中得到注釋。

2.2.2雙生子不同共表達基因的功能注釋比較將雙生子共表達基因輸入FatiGO Compare數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋比較，移去兩組基因中相同的基因，大雙473個共表達基因中有321個基因獲得注釋，小雙529個共表達基因中有206個基因獲得注釋。在GO生物學過程、分子功能及細胞成分3個層次，分別有2、3和3個GO術(shù)語在雙生子間有顯著性差異(P<0.05)，見表2。在KEGG通路注釋比較差異沒有顯著性(P>0.05)。

表2雙生子不同共表達基因功能注釋比較〔n(%)〕

GO術(shù)語GO類別/水平小雙基因數(shù)目大雙基因數(shù)目P值分子功能調(diào)節(jié)(GO:0065009)生物學過程/35(29.2)0(71.8)0.01生物刺激反應(GO:0009607)生物學過程/30(0)8(100)0.02RNA結(jié)合(GO:0003723)分子功能/42(18.4)13(81.6)0.03核糖核蛋白復合體(GO:0030529)細胞成分/60(0)7(100)0.04

3討論

T2DM是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所形成的復雜疾病。研究〔4，5〕表明，T2DM在同卵雙生子中具有高度的患病一致性，但是即便是同卵雙生子，T2DM的患病仍然具有差異性和非同步性的特點，具體表現(xiàn)為發(fā)病時間的不一致性、病情輕重程度的差異性以及并發(fā)癥出現(xiàn)的不同性等。本研究選擇的雙生子姐妹為同卵雙胞胎，雖然都確診患T2DM，但二者病程、輕重程度及兼癥等都有很大的不同。和大雙相比，小雙T2DM發(fā)病時間早、病情程度重，在連續(xù)2年的6個觀測點上，空腹血糖值均明顯高于大雙，血糖控制不理想。隨著病程的延長，二者的病情程度均有加重，但是加劇的程度不一致，小雙出現(xiàn)腎功的輕度損傷。說明同卵雙生子雖然遺傳基礎相同，所患疾病名稱相同，但是疾病的具體表現(xiàn)形式仍存在很大的差異。 通過對雙生子連續(xù)2年6個時間點基因表達譜數(shù)據(jù)的綜合分析，篩選出了大雙和小雙跟病情發(fā)展相關(guān)的共表達基因473和529個。這些共表達基因的表達量均隨著病程的延長而逐漸增加，因此可認為這些基因和T2DM的病情加劇密切相關(guān)。雙生子兩組共表達基因中有15條相同的基因，GO功能注釋“T細胞活化調(diào)節(jié)”出現(xiàn)顯著性。T細胞在特異性免疫應答中起關(guān)鍵性作用，不僅負責細胞免疫，對體液免疫也起重要的輔助和調(diào)節(jié)作用〔6〕，而且在老年T2DM患者中，T細胞亞群數(shù)量和各亞群之間的比例和患者的血糖水平明顯相關(guān)〔7〕，提示免疫功能紊亂是這對雙生子T2DM隨病程延長而穩(wěn)定出現(xiàn)的共性特征。雙生子之間不同的共表達基因在多個GO術(shù)語得到注釋，這些術(shù)語中有顯著性差異的GO主要為分子功能調(diào)節(jié)和生命刺激兩類，說明同卵雙生子T2DM患病分子基礎的差異性，差異的形成主要與雙生子間的個體因素及生活環(huán)境的不同有關(guān)，值得深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)這對老年雙生子T2DM患病分子基礎既存在共性又存在差異，共性特征是都存在免疫功能的異常，差異性主要體現(xiàn)在二者分子功能調(diào)節(jié)及刺激反應等方面的調(diào)節(jié)不同。

4參考文獻

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〔2013-09-12修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)