量子點(diǎn)多重染色在卵巢癌體外成像的應(yīng)用

葉稱(chēng)連1傅芬1聶麗菊1陳進(jìn)聰許恒毅

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330006)

摘要〔〕目的利用量子點(diǎn)(QDs)免疫熒光技術(shù)對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞上葉酸受體(FR)及人附睪蛋白(HE)4進(jìn)行定位，初步揭示QDs多重染色在卵巢癌細(xì)胞體外成像的應(yīng)用價(jià)值。方法采用活潑酯法，構(gòu)建不同發(fā)射波長(zhǎng)的QDs-鏈霉親和素(SA)復(fù)合物，分別與生物素化-葉酸(FA)及生物素化-抗HE4抗體結(jié)合，形成特異性熒光探針，同時(shí)靶向結(jié)合SKOV3細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞雙重染色。結(jié)果構(gòu)建的QD-FA及QD-抗HE4抗體靶向探針具有極強(qiáng)的特異性，量子點(diǎn)多重染色的熒光強(qiáng)度與單重染色相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。量子點(diǎn)具有極強(qiáng)的光學(xué)穩(wěn)定性。結(jié)論量子點(diǎn)多重染色在卵巢癌細(xì)胞體外成像中具有一定的應(yīng)用價(jià)值，可為卵巢癌早期檢測(cè)提供一種新思路。

關(guān)鍵詞〔〕量子點(diǎn)；多重染色；卵巢癌；體外成像

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R737.3〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

通訊作者：許恒毅(1981-)，男，副教授，主要從事毒理學(xué)研究。

1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院

第一作者：葉稱(chēng)連(1987-)，女，碩士，主要從事婦科腫瘤研究。

The application of multiplexed quantum dots staining in ovarian cancer imaging in vitro

YE Chen-Lian, FU Fen, NIE Li-Ju,etal.

State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047,Jiangxi, China

Abstract【】ObjectiveTo detect the folate receptor (FR) and human epididymis protein 4 (HE4) receptor localization in ovarian cancer SKOV3 cells simultaneously by quantum dots (QDs) immunofluorescence technique, and validate the application value of multiplexed QDs staining.MethodsThe streptavidin (SA)-QDs compounds with different emission wavelength was established by active ester method. These compounds could be coupled with biotinylated folate and biotinylated anti-HE4 antibody, forming specific fluorescent probes to target bind SKOV3 cells simultaneously, to realize cells double staining.Results(1) The QD-FA and QD-HE4 target probes had strong specificity. (2) There was no significant difference in fluorescence intensity between QDs multiple staining and single staining. (3) QDs had strong optical stability.ConclusionsMultiplexed QDs staining has its application value in ovarian cancer in vitro imaging and could be a new thinking in ovarian cancer early detection.

【Key words】Quantum dots; Multiplexed staining; Ovarian cancer; Imaging in vitro

量子點(diǎn)(QDs)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型納米發(fā)光粒子，相對(duì)于傳統(tǒng)染料，它具有熒光強(qiáng)度高、熒光壽命長(zhǎng)、抗光漂白能力強(qiáng)、激發(fā)波譜寬、發(fā)射波譜窄及可同時(shí)激發(fā)多重?zé)晒獾泉?dú)特的光學(xué)特性。這些特性使其可作為一種新型標(biāo)記物應(yīng)用于腫瘤的分子病理及體外成像診斷。QDs的體外成像最初是通過(guò)QDs單重染色來(lái)實(shí)現(xiàn)的，近年來(lái)，有多項(xiàng)研究表明QDs多重染色相對(duì)于單重染色在腫瘤細(xì)胞及組織體外成像上具有優(yōu)越性〔1，2〕。本文針對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3表達(dá)的葉酸受體(FR)和人附睪蛋白(HE)4，構(gòu)建生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)(BAS)介導(dǎo)的QD-葉酸(FA)及QD-抗HE4抗體靶向探針，同時(shí)靶向結(jié)合SKOV3細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)多重染色在細(xì)胞體外成像的應(yīng)用，為卵巢癌的早期檢測(cè)提供新思路。

1材料及方法

1.1主要試劑、材料與儀器水溶性QSH550及QSH620(Ocean NanoTech公司，羧基功能化)，生物素氨己基-N-羥基丁二酰亞胺活性酯、鏈霉親和素(SA)(華藍(lán)化學(xué)公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(南京森貝伽生物科技有限公司)，1-乙基-3-〔3-二甲基氨基丙基〕碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，生物素化-FA(本實(shí)驗(yàn)室前期合成)，HE4羊多克隆抗體(SANTA CRUZ生物公司)，F(xiàn)ITC-兔抗羊IgG(EARTH生物公司)，其他試劑均為分析純；卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞由江西省南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)；倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(BOYANG公司)，直熱式CO2培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司)等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1QD-SA的合成分別取適量QSH620及QSH550(濃度分別為8 μmol/L及8.3 μmol/L)溶于pH5.5的硼酸鹽緩沖液中(BB)，采用活潑酯法，按照QD：EDC/NHS摩爾比1∶500加入EDC/NHS，室溫反應(yīng)5～10 min。調(diào)整溶液pH到8～8.5，按摩爾比40∶1加入SA，持續(xù)混勻2 h后，加入10 μl含5%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)，封閉10 min終止反應(yīng)。耦聯(lián)的QD-SA復(fù)合物10 000 r/min下離心5 min除去少量沉淀，用pH7的BB在100 K超濾管中洗滌(10倍體積交換)，最后重懸于0.1 ml pH7的BB中。

1.2.2生物素化HE4的合成取HE4山羊多克隆抗體(濃度為200 μg/ml) 20 μl溶于400 μl pH7.4的1倍PBS溶液中，按生物素∶抗體摩爾比40∶1加入長(zhǎng)鏈生物素5.6 μg，混勻，室溫反應(yīng)4 h，將最終反應(yīng)的混合溶液置于4℃1×PBS溶液中透析3 d，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3QDs單重染色在卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外成像的應(yīng)用獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞及肺癌A549細(xì)胞種植于96孔板中，細(xì)胞數(shù)約1×104/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。1倍PBS沖洗3次，采用4%甲醛在常溫下固定細(xì)胞15 min，立即用含1%牛血清蛋白(BSA)的Tris緩沖液(TBS-BSA)沖洗3次，用含0.1%吐溫-20的TBS滲透細(xì)胞20 min，TBS-BSA沖洗3次后用TBS/0.1%酪氨酸/5%BSA混合液封閉細(xì)胞上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h。沖洗后分別加入生物素化FA(0.25 mg/ml)或生物素化抗HE4抗體(1∶50)在常溫下共孵育2 h，用TBS-BSA沖洗3次(每次5 min)，分別加入50 nmol/L的QD550-SA或QD620-SA反應(yīng)30 min，沖洗3次脫色，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核30 min，沖洗3次后立即在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞成像，每組重復(fù)3次。

1.2.4量子點(diǎn)多重染色在卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外成像的應(yīng)用量子點(diǎn)多重染色采用循環(huán)染色的方法，細(xì)胞的前期處理如上所述，經(jīng)過(guò)固定、滲透后，細(xì)胞先與生物素化FA共孵育2 h，TBS-BSA沖洗3次后，加入50 nmol/L QD550-SA反應(yīng)30 min，沖洗3次脫色，作為第一個(gè)循環(huán)。從封閉開(kāi)始進(jìn)行第二個(gè)循環(huán)，使用TBS/0.1%酪氨酸/5%BSA混合液沖洗2次(5 min/次)，再封閉1 h，加入生物素化抗HE4抗體反應(yīng)2 h，使用QD620-SA進(jìn)行染色，最后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。為比較量子點(diǎn)染色信號(hào)，可通過(guò)變換染色順序來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5圖像采集及熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)分析使用倒置熒光顯微鏡采集所有圖像，采用ImageJ軟件進(jìn)行分析。選擇每個(gè)視野下基于視覺(jué)注意機(jī)制的感興趣區(qū)(包括至少100個(gè)細(xì)胞)，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，然后一個(gè)孔內(nèi)的細(xì)胞選擇多個(gè)視野及多個(gè)感興趣區(qū)，求得其平均熒光強(qiáng)度值。應(yīng)用SPSS17.0軟件，多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，方差齊性者兩兩比較使用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者則采用DunnetT3檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1QDs的表征QSH620在常溫下為澄清的紅色溶液，透射電子顯微鏡(TEM)顯示該粒子大小均一，平均為(8.34±3.31)nm，動(dòng)態(tài)光散射分析(DLS)表明其水化粒徑分布較集中，平均為(49.0±0.8)nm，Zeta電位為(-35.99±2.81)mV。QSH550在常溫下為澄清的綠色溶液，TEM顯示該粒子大小均一，平均為(7.38 ±2.58)nm，DLS表明其水化粒徑分布較集中，平均為(31.5±0.6)nm，Zeta電位為(-33.36±4.51)mV。

2.2量子點(diǎn)單重染色在卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外成像的應(yīng)用量子點(diǎn)對(duì)SKOV3細(xì)胞特異性抗體進(jìn)行單重染色，QD550-FA靶向結(jié)合細(xì)胞膜表面，QD550-抗HE4抗體靶向結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而FR表達(dá)于陰性的A549細(xì)胞，QD550-FA在細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯熒光(圖1A)，對(duì)照組不加抗體，QDs染色后只有細(xì)胞核DAPI顯示的藍(lán)色，證實(shí)了量子點(diǎn)-抗體復(fù)合物的特異性。同樣，采用QD620-FA及QD620-抗HE4抗體對(duì)SKOV3染色，其結(jié)果同上(圖1B)，而使用QD620-抗HE4抗體對(duì)A549進(jìn)行染色，可見(jiàn)其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)稍弱的紅色熒光，推測(cè)HE4在A549細(xì)胞上有表達(dá)，但其表達(dá)量較少。QD550-FA在SKOV3細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度可達(dá)(41.25±5.25)，而使用相同濃度的QD550-FA染色A549的熒光強(qiáng)度值僅為(3.57±0.02)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，判定A549細(xì)胞為非特異性染色效果。QD550-抗HE4抗體染色SKOV3細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值為(42.87±5.75)，稍高于QD550-FA的熒光強(qiáng)度值，推測(cè)SKOV3細(xì)胞上的HE4表達(dá)稍高于FR，但都顯著高于對(duì)照組(3.55±0.10)(P<0.01)。QD620-FA對(duì)SKOV3細(xì)胞染色的熒光強(qiáng)度為(30.20±5.52)，而QD620-抗HE4抗體的熒光強(qiáng)度為(31.88±5.12)，明顯高于QD620-抗HE4抗體對(duì)A549細(xì)胞染色的熒光強(qiáng)度(12.36±2.80)(P<0.01)。

(A)分別為QD550-FA組、QD550的control組及QD550-抗HE4抗體組對(duì)SKOV3細(xì)胞的單重染色圖，最后一組為QD550-FA對(duì)A549的單重染色圖；(B)分別為QD620-FA組、QD620的control組及QD620-抗HE4抗體對(duì)SKOV3細(xì)胞的單重染色圖，最后一組為QD620-抗HE4抗體對(duì)A549的單重染色圖 圖1　量子點(diǎn)單重染色圖

2.3量子點(diǎn)多重染色在卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外成像的應(yīng)用如圖2所示，通過(guò)不同顏色QDs標(biāo)記的特異性探針共同靶向卵巢癌SKOV3細(xì)胞，從而達(dá)到單個(gè)細(xì)胞上呈現(xiàn)多重染色的效果。圖2A為20倍鏡下SKOV3細(xì)胞膜被QD550-FA(綠色信號(hào))復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)被QD620-抗HE4抗體(紅色信號(hào))復(fù)合物分別標(biāo)記后及細(xì)胞核同時(shí)被DAPI標(biāo)記的多重染色圖，其中Merged為前三種顏色通道合并后的成像圖。在40倍鏡下可清楚地觀察到細(xì)胞質(zhì)分別被QD620-抗HE4抗體(紅色，圖2B)及QD620-抗HE4抗體(紅色，圖2C)標(biāo)記，而細(xì)胞膜被QD550-FA(綠色，圖2C)及QD620-FA(紅色，圖2B)標(biāo)記，Merged中可看到三種顏色通道合并后的成像。A549細(xì)胞作為對(duì)照，使用QD620-FA靶向作用其細(xì)胞膜，QD550-抗HE4抗體作用于其細(xì)胞質(zhì)，因其細(xì)胞膜上的FA受體表達(dá)呈陰性，故FA組未見(jiàn)明顯熒光，而HE4組可見(jiàn)較暗綠色熒光，最終Merged中只可見(jiàn)綠色及細(xì)胞核DAPI藍(lán)色組像(圖2D)。

QD550-抗HE4抗體對(duì)SKOV3染色的熒光強(qiáng)度可達(dá)到(41.22±3.10)，QD620-FA的熒光強(qiáng)度為(32.38±4.30)，與單重染色時(shí)的熒光強(qiáng)度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。QD550-FA及QD620-抗HE4抗體對(duì)SKOV3染色的熒光強(qiáng)度分別為(36.22±2.81)及(37.30±3.32)，同樣與單重染色時(shí)的熒光強(qiáng)度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

(A)20倍鏡下QD620-抗HE4抗體及QD550-FA對(duì)SKOV3細(xì)胞的多重染色結(jié)果；(B)40倍鏡下QD550-抗HE4抗體及QD620-FA對(duì)SKOV3細(xì)胞的多重染色結(jié)果；(C)40倍鏡下QD620-抗HE4抗體及QD550-FA對(duì)SKOV3細(xì)胞的多重染色結(jié)果；(D)20倍鏡下QD550-抗HE4抗體及QD620-FA對(duì)A549細(xì)胞的多重染色結(jié)果 圖2　量子點(diǎn)多重染色

2.4量子點(diǎn)穩(wěn)定性分析隨著時(shí)間的推移，QD550的熒光無(wú)明顯改變，而FITC的熒光逐漸減弱(圖3A)。QD550的熒光強(qiáng)度值在這期間始終保持在(44.00±1.57)，而FITC由0 min的(40.00±0.76)逐漸減弱到25min的(6.30±1.29)(圖3B)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明QDs有較強(qiáng)的抗光漂白能力。

(A)QD550-抗HE4抗體與二抗標(biāo)記的FITC-抗HE4抗體對(duì)SKOV3細(xì)胞染色后，在25 min內(nèi)每隔5 min的熒光變化結(jié)果；(B)為A圖每一時(shí)刻所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值 圖3　量子點(diǎn)穩(wěn)定性分析

3討論

卵巢癌在女性常見(jiàn)惡性腫瘤中發(fā)病率為2.4%～6.5%，在各型婦科惡性腫瘤中占第3位，但死亡率卻占首位，75%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期〔4〕。因而對(duì)于癌癥早期外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)將成為卵巢癌早期診斷的一個(gè)重要手段，針對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，選擇特異且具有精確靶向性的生物標(biāo)記物是檢測(cè)的重點(diǎn)。HE4最早是從人的附睪遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞中克隆到的cDNA，隨后證實(shí)了其在卵巢癌組織中高表達(dá)，而在癌旁組織中不表達(dá)〔5〕。而FA是一種分子結(jié)構(gòu)中含有蝶呤環(huán)的小分子維生素，為真核細(xì)胞單碳代謝和核苷合成所必需。有報(bào)道顯示，卵巢癌細(xì)胞表面FR呈現(xiàn)高表達(dá)(達(dá)95%以上)，利用其與FA的高親和力〔6〕，可構(gòu)建靶向標(biāo)記卵巢癌細(xì)胞或組織的特異性探針，從而達(dá)到早期診斷的目的。

利用QDs獨(dú)特的光學(xué)特性，合成的各種具有生物功能的QDs復(fù)合物目前已經(jīng)在生物標(biāo)記領(lǐng)域中被廣泛運(yùn)用。QDs直徑的可調(diào)性以及同一激發(fā)光可激發(fā)不同QDs，這些獨(dú)特特征能夠同時(shí)分析多種抗原，特別對(duì)于復(fù)雜的標(biāo)本需要分析大量參數(shù)時(shí)很有價(jià)值。本文通過(guò)利用QDs與SA耦聯(lián)的復(fù)合物作為特異性探針，能與生物素化的抗體結(jié)合，這樣形成的QDs復(fù)合物即可用于免疫熒光分析。通過(guò)構(gòu)建的QD-FA及QD-抗HE4抗體靶向熒光探針特異性標(biāo)記卵巢癌SKOV3細(xì)胞，來(lái)同時(shí)檢測(cè)定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的抗原，從而達(dá)到多重染色的目的。且相對(duì)于單重染色，多重染色在熒光強(qiáng)度的表達(dá)上無(wú)顯著性差異，并且能夠很大程度地提高檢測(cè)的靈敏度與特異性，證實(shí)了多重染色的可行性。另外，與傳統(tǒng)染料的對(duì)比，顯示了QDs的強(qiáng)抗光漂白能力及良好的穩(wěn)定性，這在多重染色的多次脫色過(guò)程中有著重要意義。

綜上，QDs多重染色可快速、準(zhǔn)確地識(shí)別卵巢癌細(xì)胞，可在細(xì)胞形態(tài)及分子水平上對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行分析，從而實(shí)現(xiàn)卵巢癌的早期診斷，可作為卵巢癌早期檢測(cè)的一個(gè)新方向。

4參考文獻(xiàn)

1Xu H，Xu J，Wang X，etal.Quantum dot-based，quantitative，and multiplexed assay for tissue staining〔J〕.ACS Applied Mater Interfaces，2013；5(8)：2901-7.

2Liu J，Lau SK，Varma VA，etal.Multiplexed detection and characterization of rare tumor cells in Hodgkin’s lymphoma with multicolor quantum dots〔J〕.Analyt Chem，2010；82(14)：6237-43.

3薛霞，楊凡，單詠梅，等.血清人附睪蛋白 4 檢測(cè)在肺癌診斷中的意義〔J〕.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)師雜志，2013；(2)：96-8.

4Siegel R，Naishadham D，Jemal A，etal.Cancer statistics，2013〔J〕.CA：Cancer J Clin，2013；63(1)：11-30.

5Roy EJ，Gawlick U，Orr BA，etal.Folate-mediated targeting of T cells to tumors〔J〕.Adv Drug Deliv Rev，2004；56(8)：1219-31.

6Nukolova NV，Oberoi HS，Cohen SM，etal.Folate-decorated nanogels for targeted therapy of ovarian cancer〔J〕.Biomaterials，2011；32(23)：5417-26.

〔2014-10-08修回〕

(編輯郭菁)