十全大補湯含藥血清對A549和A549/DDP細胞株順鉑耐藥性及凋亡的影響

高原陳奇1于寧2張洪源2敬一夫2關蕊2田子鶴2張城城2李春暉2

(遼寧中醫(yī)藥大學病理教研室，遼寧沈陽110847)

摘要〔〕目的研究十全大補湯含藥血清對人肺腺癌順鉑(DDP)敏感細胞株A549和耐藥細胞株A549/DDP耐藥性及凋亡的影響。方法將24只SD大鼠隨機分為十全大補湯含藥血清低劑量組(1.625 g/ml)、中劑量組(3.25 g/ml)、高劑量組(6.5 g/ml)、空白血清組(等體積生理鹽水)，每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d后提取血清；MTT法檢測各組細胞對DDP的半數抑制濃度(IC50)值，并計算耐藥指數；Annexin Ⅴ/PI法檢測各組細胞的早期凋亡率。結果A549細胞中，中、高劑量組IC50值均較空白血清組下降(均P<0.01)，而中劑量組的IC50值與高劑量組無差別，但較低劑量組顯著降低(P<0.05)；A549/DDP細胞中，低、中、高劑量組的IC50值均較空白血清組下降(均P<0.01)，而中劑量組IC50值與高劑量組無差別，但較低劑量組顯著降低(P<0.01)；DDP處理A549細胞后，中、高劑量組分別增加細胞的早期凋亡率(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量組之間無差別(P>0.05)，但中劑量組較低劑量組增加細胞的早期凋亡率(P<0.05)；DDP處理A549/DDP細胞后，低、中、高劑量組均增加細胞的早期凋亡率(P<0.05，P<0.01)，但中、高劑量組之間無差別，而中劑量組較低劑量組增加細胞的早期凋亡率(P<0.05)。結論十全大補湯含藥血清對A549及A549/DDP細胞均有降低DDP耐藥性的協(xié)同增效作用，可能與其促進腫瘤細胞凋亡有關；在A549/DDP細胞中十全大補湯含藥血清的協(xié)同增效作用更強，且中劑量含藥血清效率最高、效果最佳。

關鍵詞〔〕肺腺癌；十全大補湯；化療耐藥；細胞凋亡

中圖分類號〔〕R273〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(81403303)；遼寧省教育廳科學研究項目(L2012333)；中國博士后科學基金(2014M551122)

1遼寧省體育科學研究所生理研究室

2遼寧中醫(yī)藥大學第一臨床學院

第一作者：高原(1980-)，女，博士，副教授，主要從事中藥調節(jié)腫瘤耐藥作用及其機制的研究。

Effect of serum containing Shiquan Dabu decoction on cisplatin-resistance and apoptosis of A549 and A549/DDP cells

GAO Yuan, CHEN Qi, YU Ning,etal.

Department of Pathology, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of serum containing Shiquan Dabu decoction on cisplatin(DDP)-resistance and apoptosis of lung adenocarcinoma line A549, and its DDP-resistant subline A549/DDP.Methods24 SD rats were divided into low dose (1.625 g/ml)，moderate dose (3.25 g/ml) and high dose (6.5 g/ml) groups of Shiquan Dabu decoction and blank serum group (isometric normal saline). MTT assay was used to determine IC50 values of DDP. Annexin Ⅴ/PI staining method was used to detect early apoptosis.ResultsIn A549 cells, IC50 in moderate and high dose groups were lower than those of blank serum group (all P<0.01), there was no difference between moderate and high dose groups(P>0.05); however, IC50 in moderate group was lower than those of low dose group(P<0.05). In A549/DDP cells, IC50 in low, moderate and high dose groups were lower than that of blank serum group (all P<0.01), there was no difference between moderate and high dose groups(P>0.05), however, IC50 in moderate group was lower than that of low dose group (P<0.01). In A549 cells, the early apoptosis rate in moderate and high dose groups were higher than those of blank serum group(P<0.05，P<0.01), there was no difference between in moderate and high dose groups (P>0.05), however, the early apoptosis rate in middle group was higher than that of low dose group (P<0.05). In A549/DDP cells, the early apoptosis rate in low, moderate and high dose groups were higher than those of blank serum group (P<0.05，P<0.01), there was no difference between in moderate and high dose groups (P>0.05), however, the early apoptosis rate in moderate group was higher than that of low dose group (P<0.01).ConclusionsThe serum containing Shiquan Dabu decoction moderately have the synergistic effect of cisplatin-resistance on A549 and A549/DDP cells through promoting the apoptosis, and moderate dose has the best advantage.

【Key words】Lung adenocarcinoma; Shiquan Dabu decoction; Chemotheraphy resistance; Apoptosis

十全大補湯是益氣補血、扶正固本的經典方，由四君子湯、四物湯加黃芪、肉桂組成。已有研究發(fā)現，十全大補湯可以抑制腫瘤生長、抑制腫瘤侵襲和轉移、增強機體免疫系統(tǒng)功能、降低化療藥物對機體的損傷等〔1～3〕。本實驗擬觀察十全大補湯含藥血清對A549和A549/順鉑(DDP)細胞株耐藥性及凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細胞株及動物A549細胞株由中國醫(yī)科大學病理教研室提供，A549/DDP細胞株購自中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所。SD大鼠由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，雌雄各半，體重190～230 g，許可證號：SCXK(遼)2013-0010。

1.2中藥及制備十全大補湯根據《方劑學》(中國中醫(yī)藥出版社，鄧中甲主編)中規(guī)定用藥及臨床常用劑量(人參6 g，肉桂3 g，川芎6 g，熟地黃12 g，茯苓9 g，白術9 g，甘草3 g，黃芪12 g，當歸9 g，白芍9 g)，全部藥材購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，并通過遼寧中醫(yī)藥大學藥理實驗室的鑒定，加水浸泡30 min后，按湯劑常規(guī)方法煎熬，過濾并濃縮成生藥量含量為10 g/ml的藥液，冷卻后裝入滅菌藥瓶，4℃保存。

1.3試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、DMSO購自韓國BIOSHARP公司；DDP購自德國Calbiochem公司(Lot#D00117683)；MTT檢測試劑盒購自上海碧云天公司；Annexin V/PI檢測試劑盒購自北京四正柏公司。

貓作為我們最常見的貓科動物，已經被人類馴化了三千多年。在表示親密時，它常會蹭人類的臉頰。這是因為貓的臉頰、耳朵、下巴跟腹側，都分布著費洛蒙氣味腺，其中臉頰部位分泌出來的費洛蒙，是它感到安心舒適時才會釋放的。它會將這種氣味蹭在喜歡的地方作為標記。

1.4含藥血清的制備清潔級SD大鼠24只按隨機數字表法分為十全大補湯含藥血清低劑量組(1.625 g/ml)、中劑量組(3.25 g/ml)、高劑量組(6.5 g/ml)、空白血清組(等體積生理鹽水)。每組每天灌胃給藥1次，每次1 ml，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后，腹主動脈采血置于無菌管中，37℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min后取上清，再重復離心2次，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器濾過除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2的孵育條件下，A549細胞和A549/DDP細胞分別在含有10%胎牛血清(或10%含藥血清)的DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當細胞融合度達到90%時，用0.25%的胰酶消化傳代。

1.6MTT法檢測十全大補湯含藥血清對DDP半數抑制濃度(IC50)的影響取對數生長期的A549和A549/DDP細胞制成單細胞懸液5×103/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl，待細胞貼壁后分組：10%含藥血清低、中、高劑量組、10%空白血清組，加入含不同血清的培養(yǎng)基100 μl，每組設立6個平行對照，并設空白對照(不加細胞只加培養(yǎng)液，用于比色調零)，置正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。24 h后用2、4、8、16、32、64、128 μmol/L DDP處理細胞，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實驗終止前，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，振蕩10 min后，置于酶標自動分析儀，在570 nm波長測定光吸收值(OD值)。計算IC50值，并按以下公式計算耐藥指數：耐藥指數=A549/DDP細胞IC50值/A549細胞IC50值。

1.7Annexin Ⅴ/PI法檢測十全大補湯含藥血清對細胞凋亡率的影響取對數生長期的A549和A549/DDP細胞制成單細胞懸液106/ml，接種于6孔板中，每孔1 000 μl，待細胞貼壁后分組(同MTT法)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后用20 μmol/L DDP處理細胞〔4〕，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化收集于1.5 ml離心管內。用預冷4℃無菌的PBS充分洗滌細胞2次，取總數1×106/ml的細胞待檢測。用250 μl結合緩沖液重新懸浮細胞并使其濃度為(2～5)×105/ml。取195 μl的細胞懸液加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻后間隔3 min再加入10 μl濃度為20 μg/ml的碘化丙錠溶液?；靹蚝笥谑覝乇芄夥跤?0 min。加300 μl結合緩沖液，輕輕混勻，上流式細胞儀(FACS)進行檢測分析。

2結果

2.1十全大補湯含藥血清對A549和A549/DDP細胞生長狀態(tài)的影響倒置顯微鏡顯示，空白血清組的A549細胞呈長梭形，成簇生長，折光性較弱；而A549/DDP細胞略呈三角形，較A549細胞形態(tài)飽滿，成簇生長，折光性較弱；經DDP處理后，空白血清組、十全大補湯含藥血清低劑量組細胞均明顯變狹窄，突起增多，稀疏生長，或呈圓形懸浮狀態(tài)，折光性較強；而經DDP處理后，十全大補湯含藥血清中、高劑量組兩種細胞呈長梭形或三角形，成簇生長較明顯。

2.2A549和A549/DDP細胞對DDP的耐藥性DDP對A549和A549/DDP細胞的IC50值分別為(5.888±0.338)μmol/L和(28.984±1.404)μmol/L，耐藥指數為4.92。

2.4十全大補湯含藥血清對A549和A549/DDP細胞凋亡的影響DDP處理A549細胞后早期凋亡率為(39.38±0.88)%，DDP聯(lián)合中、高劑量含藥血清處理分別增加細胞的早期凋亡率〔(40.64±0.35)%,(41.59±0.42)%〕(P<0.05，P<0.01)，但中、高劑量之間無差別，而DDP聯(lián)合低劑量含藥血清處理后細胞的早期凋亡率〔(39.48±0.56)%〕與空白血清無明顯差異，但DDP聯(lián)合中劑量含藥血清較低劑量含藥血清處理增加細胞的早期凋亡率(P<0.05)。DDP處理A549/DDP細胞后早期凋亡率為(21.75±0.96)%，DDP聯(lián)合低、中、高劑量含藥血清處理均增加細胞的早期凋亡率〔(23.03±0.20)%,(24.35±0.38)%,(25.41±0.61)%〕(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，但中、高劑量之間無差別，而DDP聯(lián)合中劑量含藥血清較低劑量含藥血清處理增加細胞的早期凋亡率(P<0.05)。

3討論

目前，西醫(yī)治療肺癌主要采取手術治療、放射治療、化學藥物治療及免疫(生物)治療，但因為肺癌出現較晚且不易早期發(fā)現，80%～90%的中、晚期患者確診時已存在著不同程度的癌細胞播散，常已失去手術根治的機會，只能行化療；但因腫瘤較大，多數僅有姑息效果，遠期療效甚微。導致化療失敗的重要原因是腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥。鉑類藥物是肺癌聯(lián)合化療的核心，DDP是當前對肺癌患者單制劑化療及聯(lián)合化療效率較高的藥物之一。文獻報道十全大補湯可協(xié)同順鉑的藥效并減輕腫瘤患者的化療反應〔5〕。

現代臨床及實驗研究均證實，順鉑多會引起不同程度的骨髓抑制和消化道反應，在癥狀上主要表現為虛羸少氣、畏寒肢冷、食少納差等〔6〕，屬中醫(yī)“氣血虧虛”范疇。其病因主要是正虛邪實、藥毒攻伐所致。病機為毒邪久滯、氣血不暢、積聚成瘀，引起氣血阻滯，正氣耗傷?；熕幬锲品e消癰，類似中醫(yī)“消法”，但攻伐太過，損傷脾胃，胃失受納，脾失健運，氣血生成不足。十全大補湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由四君子湯(人參、茯苓、白術、甘草)、四物湯(當歸、熟地、川芎、白芍)加黃芪、肉桂組成，為氣血雙補的經典名方?！短交菝窈蛣┚址健酚涊d：“十全大補湯治男子、婦人諸虛不足，五勞七傷，不進飲食，久病虛損，……一切病后氣不如舊，……喘咳中滿，脾腎氣弱，五心煩悶，并皆治之。”其中人參、黃芪、熟地為主，甘溫益氣養(yǎng)血；輔以白術健脾燥濕，茯苓健脾滲濕，二藥協(xié)人參、黃芪補脾肺之氣，實后天氣血生化之源；當歸、白芍養(yǎng)血和營，協(xié)熟地以益心調肝生血，炙甘草和中益氣，調和諸藥；川芎活血行氣，使補而不滯；肉桂補腎助陽，振奮陽氣，鼓舞氣血生長；姜棗可調和脾胃〔7〕。

本研究中低、中、高劑量十全大補湯都有增強A549/DDP細胞DDP化療效果的作用，可能與它們促進腫瘤細胞凋亡有關。較低劑量的含藥血清即可對A549/DDP細胞產生協(xié)同增效作用，而較高劑量的含藥血清才對A549細胞起效，我們推測十全大補湯含藥血清對DDP耐藥細胞株的作用強于DDP敏感細胞株。同時，中劑量十全大補湯含藥血清對兩種細胞DDP化療的協(xié)同增效作用與高劑量相當，而中劑量含藥血清對兩種細胞在降低耐藥性和促進凋亡的作用上強于低劑量含藥血清。因此，中劑量十全大補湯含藥血清對DDP化療的協(xié)同增效作用效率最高、效果最佳。

4參考文獻

1郭剛，許建華.十全大補湯抑制腫瘤侵襲、轉移的研究概述〔J〕.環(huán)球中醫(yī)藥，2011；4(1)：74-6.

2郭剛，許建華，韓建宏，等.十全大補湯對荷瘤小鼠結腸癌原發(fā)腫瘤切除后轉移瘤生長及血管生成的影響〔J〕.中西醫(yī)結合學報，2012；10(4)：436-47.

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4Gao Y，Liu Z，Zhang X，etal.Inhibition of cytoplasmic GSK-3β increases cisplatin resistance through activation of Wnt/β-catenin signaling in A549/DDP cells〔J〕.Cancer Lett，2013；336(2):231-9.

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7陳奇.中成藥名方藥理與臨床〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：19-37.

〔2014-10-20修回〕

(編輯李相軍)