何本進(jìn)　梁慶華　胡才友　孫　亮　朱小泉　原惠萍　楊　帆　李星慧

秦嬌琴1,2　賈春媛2　韓　晶2　杜建財(cái)2　張翻弟2　楊　澤2

國(guó)家科技部十二五支撐計(jì)劃(2012BAI10B01)； 北京市科技新星計(jì)劃(Z121107002512058)

晝夜節(jié)律與衰老的研究

何本進(jìn)1,2梁慶華1※胡才友1※孫亮2朱小泉2原惠萍2楊帆2李星慧2

秦嬌琴1,2賈春媛2韓晶2杜建財(cái)2張翻弟2楊澤2

國(guó)家科技部十二五支撐計(jì)劃(2012BAI10B01)； 北京市科技新星計(jì)劃(Z121107002512058)

【摘要】多數(shù)生物是以24小時(shí)或近似24小時(shí)為周期而顯示出明顯的晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律控制著覺醒與睡眠的更替，即使在全天照明或黑暗的環(huán)境條件下也照常運(yùn)行。盡管在無光照條件下，晝夜節(jié)律也能自由運(yùn)行，但光照對(duì)于該節(jié)律的設(shè)置調(diào)整則具有重要作用。通過溫度改變、人工光照或人工黑暗條件，監(jiān)測(cè)生物的生理、生化等活動(dòng)是否會(huì)隨晝夜節(jié)律的改變而發(fā)生變化。本文主要就纖細(xì)裸藻在溫度或光照等條件的改變下，其細(xì)胞分裂周期、酶活性、芳香族氨基酸代謝等生理生化活性變化進(jìn)行了綜述。

【關(guān)鍵詞】纖細(xì)裸藻晝夜節(jié)律細(xì)胞分裂周期晝夜振蕩器

纖細(xì)裸藻Z的生理組織已被廣泛研究超過了40年[1～5]。這種裸藻能夠在各種合成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，或者在CO2，VitB1和VitB12存在時(shí)進(jìn)行光合自養(yǎng)，或者在光或暗條件下，碳源從乙酸乙酯和乙醇到乳酸、乙酸、谷氨酸和蘋果酸，在pH有很大范圍變動(dòng)時(shí)進(jìn)行有機(jī)自養(yǎng)。這種生長(zhǎng)方式的功能多樣化，與細(xì)胞分裂結(jié)合，通過24小時(shí)的光照日程表和溫度循環(huán)[6～8]，很容易地被同步化，使裸藻作為生理生化研究成為一種重要的試驗(yàn)性生物。

如表1所示，已經(jīng)報(bào)道過許多持續(xù)的晝夜節(jié)律。這些研究得助于以下事實(shí)：數(shù)天或者數(shù)周后裸藻在細(xì)胞濃度上很少甚至不發(fā)生任何變化，仍維持“靜止”的生長(zhǎng)相(超晝夜的生長(zhǎng)模式)。從細(xì)胞分裂周期推動(dòng)力分離時(shí)，晝夜節(jié)律可以被監(jiān)測(cè)到。實(shí)際上許多光合作用突變體(甚至使缺乏葉綠體基因組的株系完全褪色)已經(jīng)被分離，但仍然有效地顯示出光的晝夜節(jié)律，作為一種生長(zhǎng)能源和潛在時(shí)鐘的時(shí)間提示，已經(jīng)消除應(yīng)用在光跨度和信號(hào)上的問題。

因此裸藻的系統(tǒng)為暫時(shí)變異提供了一個(gè)極好的例子：不同的行為、生理生化活動(dòng)沿著24小時(shí)軸線被劃分,為環(huán)境適應(yīng)和功能整合及時(shí)提供標(biāo)尺[2，3]。 峰值圖(圖1)很好地解釋了這種晝夜時(shí)間結(jié)構(gòu)，提供了一個(gè)便捷的方法去說明節(jié)律的關(guān)系(通過余弦法或其他方法分析)：晝夜(LD)循環(huán)同步化(或其他“定時(shí)者”)、生物的周期轉(zhuǎn)換或自由運(yùn)行條件[3]。

1.晝夜節(jié)律株系入選種類的調(diào)查

下面，我們較詳細(xì)調(diào)查了表1編號(hào)的晝夜節(jié)律，其中主要綜述已經(jīng)報(bào)道過，調(diào)查這些領(lǐng)域更多的新進(jìn)展。

表1　纖細(xì)裸藻的晝夜節(jié)律時(shí)間結(jié)構(gòu)

續(xù)表1

(摘自：Edmunds Jr LN, Halberg F.In: Kaiser HE, ed.Neoplasms—Comparative Pathology of Growth in Animals, Plants and Man.Baltimore, Md: Williams & Wilkins; 1981:105-134.? 1981 The Williams & Wilkins Co.)

比較纖細(xì)裸藻細(xì)胞分裂周期中晝夜節(jié)律的世代時(shí)間(g)與自由運(yùn)行周期(τ)之間的溫度效應(yīng)。(A)溫度對(duì)兩種維持在3小時(shí)光照：3小時(shí)黑暗(7,500勒克斯)的不同株系(Z為野生型；ZR為DCMU抵抗型)中平均世代時(shí)間(g)的影響。在指數(shù)生長(zhǎng)期，光強(qiáng)度沒有成為限制(通常在10,000到60,000 cell/ml之間)，在每一個(gè)溫度得到的生長(zhǎng)曲線，通過線性回歸(最小二乘法)獲得斜率，符合用直線法。(B)在3小時(shí)光照：3小時(shí)黑暗中培養(yǎng)的Z和ZR株系，細(xì)胞分裂的自由運(yùn)行晝夜節(jié)律τ的溫度補(bǔ)償。細(xì)胞分裂(r)連續(xù)發(fā)生時(shí)周期會(huì)被檢測(cè)，直到生長(zhǎng)穩(wěn)定期到達(dá)(通常細(xì)胞濃度約為100,000cells/ml)。在較低溫度下，ZR株系里這個(gè)周期有一些延長(zhǎng)。盡管Z株系可以在溫度少于22℃(ZR為18℃) 時(shí)獲得生長(zhǎng)，但節(jié)律性卻消失了。誤差線條表示±1SD。(摘自Anderson RW, Laval-Martin DL, Edmunds Jr LN.Exp Cell Res 1985; 157:144-158.? Academic Press.)圖2　不同恒溫效應(yīng)的研究

2.溫度補(bǔ)償

一個(gè)顯著的晝夜節(jié)律特性就是它們的周期，而不是振幅，僅輕微受超生理范圍的環(huán)境穩(wěn)態(tài)溫度影響。這只是預(yù)期一種功能生物鐘去測(cè)量太陽日。相反，細(xì)胞分裂周期的持續(xù)時(shí)間是高度依賴于溫度，對(duì)于裸藻更是這樣[8]。 (圖2A)一項(xiàng)不同恒溫效應(yīng)的研究，范圍16～32℃，野生型Z(與DCMU-抗ZR線一樣)的世代時(shí)間(g)，在3小時(shí)光照：3小時(shí)黑暗中通過光合自養(yǎng)分批培養(yǎng)，可以明確地說明這一依賴關(guān)系。

在不同的穩(wěn)態(tài)溫度， 3小時(shí)光照：3小時(shí)黑暗里，維持裸藻Z和ZR株系中自由運(yùn)行周期溫度補(bǔ)償?shù)囊粋€(gè)較廣泛的對(duì)比研究，在前者中發(fā)現(xiàn)溫度系數(shù)Q10為1.05 (圖2B)，表明它實(shí)際上不受溫度超過10℃(22～32℃)范圍變化的影響。晝夜時(shí)鐘也不是在ZR中得到補(bǔ)償，其中超過18～28℃溫度的范圍會(huì)觀察到Q10的平均值為1.23。然而，與典型的生化反應(yīng)速率和其他生物過程(譬如膜運(yùn)輸)相比， ZR的晝夜振蕩器僅適當(dāng)?shù)厥艿綔囟鹊挠绊?。最后發(fā)現(xiàn)Z(ZR為18℃)臨界的允許溫度為22℃：盡管在較低溫度能發(fā)生緩慢的指數(shù)生長(zhǎng)，但同步性卻沒有見到。

3.光捕獲蛋白的晝夜節(jié)律合成

在連續(xù)光照生長(zhǎng)的纖細(xì)裸藻細(xì)胞，通過在體內(nèi)用[S]甲硫氨酸標(biāo)記蛋白，Künne 和de Groot證實(shí)更早的觀察值 ——總蛋白質(zhì)合成是有晝夜節(jié)律的，甚至這個(gè)τ僅受溫度輕微影響。三種蛋白(由SDS-PAGE分離)分子質(zhì)量分別為17 kD,24 kD和60 kD， 發(fā)現(xiàn)其有節(jié)律地合成(τ ～26 h)。這個(gè)60 kD 的蛋白大概在晝夜時(shí)間(CT)11處有一個(gè)最大合成速率，而另外兩個(gè)更小蛋白約在人工的中午(CT05-08)顯示有峰值(圖3)。當(dāng)最大值和最小值相比較，合成速率振蕩超過20倍。超過16～27℃的溫度范圍, τ只有3～5小時(shí)的不同，反映出相當(dāng)好的自由運(yùn)行周期的溫度補(bǔ)償。兩個(gè)較小多肽的合成被放線菌酮抑制，而不被氯霉素抑制，意味著合成發(fā)生在80S核糖體。合成和加工后，盡管會(huì)在黑暗中慢慢降解，但它們?cè)谶B續(xù)光照時(shí)可以相當(dāng)穩(wěn)定，約為120小時(shí)。

纖細(xì)裸藻光捕獲蛋白合成的晝夜節(jié)律在12小時(shí)光照：12小時(shí)黑暗中培養(yǎng)，在連續(xù)光照中解除。在17 kD 、24 kD和60 kD蛋白的合成比率中，振蕩器可被光密度痕跡計(jì)算，這些痕跡通過細(xì)胞用[S]甲硫氨酸標(biāo)記和SDS-PAGE法 分離，掃描可沉淀蛋白分?jǐn)?shù)的熒光顯影圖獲得 。相對(duì)合成是通過標(biāo)記蛋白的相關(guān)峰值區(qū)域與它們相對(duì)應(yīng)的凝膠泳道的總積分來定量計(jì)算的 。17 kD 和24 kD蛋白稍后被鑒定為光捕獲葉綠素蛋白(LHCPs )家族。(摘自 Künne A, Pistorius E, de Groot E.Eur J Cell Biol，1997，73:175-181.? Urban & Fischer Verlag.)圖3　光捕獲蛋白的晝夜節(jié)律合成

隨后，兩個(gè)較小蛋白質(zhì)被鑒定為光捕獲葉綠素蛋白質(zhì)(LHCPs)家族，Ⅰ類(17kD) 和Ⅱ類(24kD)，由抗LHCP Ⅱ血清檢測(cè)，二維PAGE分離的蛋白質(zhì)N-末端序列。盡管LHCPs的總量幾乎在12小時(shí)光照:12小時(shí)黑暗中保持恒定，但與光照相位最大的合成量相比，新合成17kD和24kD蛋白質(zhì)的量約改變20倍。相比之下，其特異的mRNAs只是輕微不同，有研究(應(yīng)用轉(zhuǎn)錄抑制劑證實(shí))發(fā)現(xiàn)：與大多數(shù)高等動(dòng)物對(duì)比，LHCP合成的晝夜控制發(fā)生在翻譯水平上。LHCPs合成的節(jié)律性完全可能在裸藻光合作用的晝夜節(jié)律控制中起到重要作用(見表1)。

4.酶活性的晝夜節(jié)律

裸藻中一些酶的活性已顯示經(jīng)歷晝夜節(jié)律的變化，更多最新的典型實(shí)例見表1。

5.芳香族氨基酸代謝

纖細(xì)裸藻Z有兩個(gè)重要的芳香族氨基酸代謝酶——色氨酸2,3-雙加氧酶(TDO)和酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)表現(xiàn)出不同的節(jié)律模式。這兩種酶由共同的調(diào)節(jié)機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，尤其是對(duì)于氨基酸向糖異生的控制。而TDO在連續(xù)光照里表現(xiàn)出顯著的晝夜節(jié)律(峰值活動(dòng)在CT18)，TAT以一個(gè)次晝夜的周期振蕩(τ = 4.26小時(shí))。甚至在12小時(shí)光照：12小時(shí)黑暗里,TAT表現(xiàn)出一個(gè)次晝夜的時(shí)間(～4.63小時(shí))。因此，從動(dòng)力學(xué)的角度看，這兩種酶是可以分離的。在相同條件下，其他變量比如趨光性，細(xì)胞形狀和總蛋白質(zhì)合成也在晝夜節(jié)律的控制下(見表1)。

6.NAD激酶、NADP磷酸酶和線粒體鈣循環(huán)

上圖：在纖細(xì)裸藻緩慢分開自養(yǎng)的細(xì)胞，體內(nèi)NAD+和總NADP(H)的含量的晝夜變動(dòng)，仍維持在3小時(shí)光照：3小時(shí)黑暗。在不同的晝夜時(shí)間抽取兩個(gè)不同相位的，自由運(yùn)行的細(xì)胞樣本，應(yīng)用酶法(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)2～5次測(cè)定)，分光光度計(jì)法測(cè)量NAD+的含量。曲線連接在CT()獲得的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值?？侼ADP(H)同以上操作(o 和·)。下圖：典型生長(zhǎng)曲線對(duì)于兩者之一分析細(xì)胞非常相像。(在對(duì)數(shù)標(biāo)尺上)劃分細(xì)胞濃度作為CT ()的功能。很小的因子增加(ss=1.14)表明在周期里，只有自由運(yùn)行群體的14%被分開 ，而在分裂間期，體內(nèi)NAD+增加的數(shù)量達(dá)70%。(摘自： Goto K, Laval-Martin D, Edmunds Jr LN.Science，1985，228:1284-1288.? American Association for the Advancement of Science.)圖4　NAD+和總NADP含量的晝夜變動(dòng)

什么是調(diào)節(jié)這些酶的元素?因?yàn)樵谠S多植物中Ca2+-鈣調(diào)蛋白激活NAD+激酶，包括綠藻、海膽，因?yàn)镹AD+激酶和NADP+磷酸酶的活性似乎由浮萍屬體內(nèi)復(fù)合物水平中的節(jié)律產(chǎn)生，它也將可能是綠藻時(shí)鐘元素的候選。或者用2小時(shí)到3小時(shí)氯四環(huán)霉素脈沖，可透過膜的Ca2+螯合劑直接引起Ca2+的短暫減少，或者通過W7和氯丙嗪——兩個(gè)鈣調(diào)蛋白抑制劑的相似短脈沖來暫時(shí)抑制Ca2+-鈣調(diào)蛋白，試圖干擾時(shí)鐘。 所有這三種藥都相位漂移分裂節(jié)律。它們的相位反應(yīng)曲線暗示，胞漿Ca2+和鈣調(diào)蛋白組成時(shí)鐘的齒輪。如果是這樣，裸藻中將會(huì)有另外一個(gè)齒輪直接調(diào)節(jié)Ca2+的水平。許多非晝夜系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)位點(diǎn)為原生質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體。為了檢測(cè)可能性，線粒體的Ca2+運(yùn)輸系統(tǒng)也許是一個(gè)時(shí)鐘齒輪，用氮?dú)狻⒍趸椒?，或者乙酸鈉，細(xì)胞會(huì)振蕩(2～3小時(shí))，所有這些都影響電子轉(zhuǎn)移，ATP水解和線粒體的Ca2+外流。每一種試劑都相位漂移分裂節(jié)律。

基于這些發(fā)現(xiàn)，Goto 等擬建一個(gè)模型，其中NAD+、線粒體的Ca2+-運(yùn)輸系統(tǒng)、Ca2+、鈣調(diào)蛋白、NAD+激酶和NADP+磷酸酶將代表全部的時(shí)鐘元素，可能組成一個(gè)自激的，晝夜振蕩環(huán)——不是這個(gè)“時(shí)鐘”而最可能是一個(gè)“時(shí)鐘商店”的振蕩器。這個(gè)擬建的反饋回路能自動(dòng)振蕩，因?yàn)檫@個(gè)“交互耦合” 總是起相反的信號(hào)。這兩種酶的節(jié)律性活動(dòng)會(huì)因?yàn)镃a2+-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物，其中一個(gè)效應(yīng)器在胞質(zhì)濃度的晝夜變化，反相振蕩180°，從而激活NAD激酶，但抑制 NADP磷酸酶。

隨后體內(nèi)研究在連續(xù)黑暗里，裸藻ZC突變株的兩種同步分裂和自由運(yùn)行分裂細(xì)胞的可溶的膜結(jié)合部分，在NAD激酶和NADP磷酸酶的活動(dòng)中檢測(cè)到晝夜節(jié)律變化。在分裂細(xì)胞(峰值在CT00 和 CT12)發(fā)現(xiàn)總NADP磷酸酶活性中雙峰的晝夜節(jié)律。當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)停止分裂，在CT00-03處可觀察到峰值的消失，有一種結(jié)果提示，這可能受細(xì)胞分裂周期所調(diào)節(jié)。NAD激酶活性，在分裂細(xì)胞中顯示單峰的晝夜節(jié)律(峰值在CT12)，在細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入靜止的生長(zhǎng)相后，其繼續(xù)保持相同的相位。在不同的晝夜節(jié)律，Km及飽和的條件下，測(cè)量由酶催化的反應(yīng)相對(duì)速度，并計(jì)算它們的比率。由NADP磷酸酶獲得的值顯示節(jié)律性的復(fù)模式，而由NAD激酶獲得的值顯示，在酶活性中，晝夜變動(dòng)與節(jié)律非常相關(guān)。兩個(gè)分裂及不分裂的細(xì)胞在CT00-04顯示曲線的波谷；分別從一個(gè)分裂或靜止的細(xì)胞中取樣，細(xì)胞在CT18-20或CT08-14顯示峰值。這樣的變化表明酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的改變，其反映的是親和力的修飾或者因?yàn)樾?yīng)器(如Ca2+-鈣調(diào)蛋白)或者因?yàn)镹AD+的底物。原因可能是：①在不同的晝夜時(shí)間中，不同同工酶的表達(dá)；②酶的不同翻譯后修飾；③晝夜方式中效應(yīng)器濃度的不同。

7.腺苷酸環(huán)化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)、環(huán)腺苷酸(cAMP)和環(huán)鳥苷酸(cGMP)

在(12小時(shí)光照：12小時(shí)黑暗)產(chǎn)生或者(1/2小時(shí)光照：1/2小時(shí)黑暗)自由運(yùn)行環(huán)境下，分裂和不分裂光合自養(yǎng)的纖細(xì)裸藻野生型Z細(xì)胞里，發(fā)現(xiàn)總cAMP含量有雙峰的晝夜節(jié)律(峰值在CT09-14, CT19-22)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，cAMP含量的雙峰節(jié)律受周期振蕩器(CO)調(diào)節(jié)，而不是依賴細(xì)胞分裂周期(CDC)。

同樣地，在cAMP的水平上，無葉綠素的ZC突變株的細(xì)胞也展現(xiàn)出雙峰的晝夜節(jié)律變化(圖5)。cAMP 水平的最大值出現(xiàn)在光周期的起始(CT00-02, 細(xì)胞處在G1期)和黑暗的開始(CT12-14, 對(duì)應(yīng)于 M期的起始)。這些變化好像是獨(dú)立的細(xì)胞分裂周期，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞已到靜止期，它們?nèi)猿掷m(xù)(圖5B,C)，然而較多新近結(jié)果指出，在后期靜止條件下的細(xì)胞群體，cAMP 水平的振幅也許變得減弱。通過光信號(hào)，由細(xì)胞節(jié)律的相位重置優(yōu)先得到——在某種程度上，通過相位反應(yīng)曲線(PRC)預(yù)測(cè)，cAMP濃度里的這些振蕩通過光信號(hào)能被相位漂移。

在同時(shí)分裂和不分裂無葉綠素的纖細(xì)裸藻ZC突變株(Z株)細(xì)胞，自由運(yùn)行cAMP水平的振幅在16.5℃，添加有乙醇(0.1%, v/v) 的礦質(zhì)細(xì)胞基上生長(zhǎng)。(A)在細(xì)胞里體現(xiàn)出有節(jié)律的細(xì)胞分裂，cAMP水平的晝夜變化，通過12小時(shí)光照：12小時(shí)黑暗循環(huán)向24小時(shí)周期改變。(B)細(xì)胞停止分裂后cAMP水平的雙峰24小時(shí)振蕩的持續(xù)性。(C)剛進(jìn)入靜止生長(zhǎng)期和在DD (τ=27小時(shí))顯示自由運(yùn)行分裂節(jié)律的細(xì)胞cAMP水平的變化。為了試驗(yàn)A和B，從兩種細(xì)胞中通過異相晝夜循環(huán)改變，超過一個(gè)12小時(shí)時(shí)間間隔，每2小時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞抽提物，這樣掃描整個(gè)晝夜周期。雙繪制(開符號(hào))結(jié)果作為晝夜時(shí)間(CT)功能。在試驗(yàn)C中，超過一個(gè)34小時(shí)時(shí)間間隔，每2小時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞提取物。為了使曲線A和B容易對(duì)比，結(jié)果規(guī)范到一個(gè)24小時(shí)周期。(摘自Carré I, Laval-Martin DL, Edmunds Jr LN.J Cell Sci, 1989, 94:267-272.?1993 The Company of Biologists, Ltd.)圖5　Z株細(xì)胞cAMP水平的晝夜變化

cAMP代謝路徑的關(guān)鍵因素是負(fù)責(zé)生成和降解的兩個(gè)酶，也就是腺苷酸環(huán)化酶(AC)和磷酸二酯酶(PDE)。在12小時(shí)光照:12小時(shí)黑暗里，發(fā)現(xiàn)這些酶在兩種分裂和不分裂的裸藻ZC突變株細(xì)胞里的活性，經(jīng)歷雙峰的晝夜節(jié)律變化，盡管較新的結(jié)果提示，節(jié)律的振幅在稍后靜止期群體里是衰減的。AC的最大活性出現(xiàn)在光照間隔(CT02)開始后的2小時(shí)和黑暗(CT12-14)的起始；這些時(shí)間相當(dāng)于峰值期的外形，作為cAMP 含量節(jié)律的變化，之前已有報(bào)道過(圖5)。PDE的活性也顯示每日振蕩，但有一個(gè)反相模式。在連續(xù)黑暗中，AC和PDE兩者的活性節(jié)律持續(xù)(圖6)。

在連續(xù)黑暗中維持的裸藻ZC突變株的靜止細(xì)胞，超過一個(gè)40小時(shí)時(shí)間間隔，檢測(cè)AC活性(A)和PDE活性(B)中自由運(yùn)行的晝夜節(jié)律。在這些細(xì)胞已停止分裂前，被12小時(shí)光照:12小時(shí)黑暗同步化的細(xì)胞，不久就被轉(zhuǎn)移到了DD；因?yàn)樵贑T12，最后分裂爆發(fā)的開始被當(dāng)作相位基準(zhǔn)點(diǎn)。陰影線條：人工黑夜。自由運(yùn)行周期已經(jīng)被規(guī)范為24小時(shí)。(摘自Tong J, Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci 1993; 100:365-369.?1991 The Company of Biologists, Ltd.)圖6　Z株細(xì)胞AC和PDE自由運(yùn)行的晝夜節(jié)律

毛喉素可大大激活A(yù)C的活性，高度特異的AC催化劑能直接充分刺激AC的活性，但與G蛋白無關(guān)。貫穿一天24小時(shí)，毛喉素對(duì)AC的刺激不能引起相同的效果，但可隨著晝夜時(shí)間(CT)而變化。通過體內(nèi)毛喉素脈沖，AC增強(qiáng)的程度似乎相反地依賴于AC的基礎(chǔ)水平。因?yàn)樵诓煌腃Ts，毛喉素似乎能刺激AC活性到相同最大值而不論其初始基礎(chǔ)水平，所以我們推斷，酶的振蕩活性來源于調(diào)節(jié)細(xì)胞效應(yīng)器，起源于晝夜振蕩器而不是酶蛋白自身的量的變化。

PDE是信號(hào)系統(tǒng)的一種重要成分，因?yàn)樗?fù)責(zé)合成脈沖后對(duì)cAMP 的破壞，因此允許細(xì)胞從cAMP 誘導(dǎo)的難降解狀態(tài)中恢復(fù)。我們發(fā)現(xiàn)，在 CT20時(shí)，向完整細(xì)胞中添加50 μM 的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，相當(dāng)于在PDE活性中節(jié)律的峰值(見圖6B)，抑制約51%PDE活性，而在CT12 (波谷期)，IBMX 只有輕微(8%)作用。在裸藻提取物中觀察到的PDE中， IBMX的這些CT依賴性抑制作用可能是對(duì)數(shù)個(gè)PDE種類的合力，其相對(duì)含量也可能隨CT變化。這些結(jié)果顯示，在生成cAMP含量的晝夜振蕩里，AC和PDE兩者的節(jié)律都是關(guān)鍵要素。

cAMP和cGMP 是第二信使，作為生物調(diào)節(jié)系統(tǒng)中二元論的“陰陽”類型，可能扮演著對(duì)立面。為了確定cGMP在裸藻的AC-cAMP-PDE 系統(tǒng)的晝夜節(jié)律性的調(diào)控中是否起作用，在同步的細(xì)胞群中監(jiān)測(cè)cAMP和cGMP 水平，測(cè)量體內(nèi)AC和PDE 的活性在cGMP 類似物8-溴環(huán)鳥苷酸(8-Br-cGMP)和cGMP 抑制物L(fēng)Y 83583 (6-苯胺基醌-5,8-醌)上的效果。在12小時(shí)光照：12小時(shí)黑暗或連續(xù)黑暗，分裂和不分裂細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)cGMP 含量的雙峰、24小時(shí)節(jié)律。cGMP 節(jié)律的峰值和波谷出現(xiàn)超過cAMP2小時(shí)。不同晝夜時(shí)間8-溴環(huán)鳥苷酸的添加，會(huì)提高體內(nèi)cAMP水平2～8倍，而LY 83583減弱cAMP節(jié)律的振幅以致消失。AC和PDE活性的8-溴環(huán)鳥苷酸效應(yīng)是依賴CT的，與cAMP 含量的變化一致。這些發(fā)現(xiàn)提示，cGMP可充當(dāng)上游的效應(yīng)器，通過AC-cAMP-PDE系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來調(diào)整cAMP振幅。

8.環(huán)腺苷酸(cAMP)水平的晝夜節(jié)律性

我們已經(jīng)討論了cAMP水平的細(xì)胞分裂周期獨(dú)立性、雙峰晝夜節(jié)律 ，野生型裸藻和無葉綠素的ZC突變株(圖5)，顯示細(xì)胞分裂的自由運(yùn)行晝夜節(jié)律。最大的cAMP 水平出現(xiàn)在光周期(細(xì)胞在G1期時(shí)CT00-02)的開始和黑夜(CT12-14,相當(dāng)于M期的開始)的起始。最近已經(jīng)報(bào)道過在煙草BY-2的同步懸浮細(xì)胞中，與細(xì)胞周期進(jìn)程緊緊連接的cAMP波動(dòng)。在G1期與 S期之間可以觀察到 cAMP的峰值。消炎痛的應(yīng)用，在動(dòng)物細(xì)胞中抑制AC的藥物，S期早期就導(dǎo)致S期cAMP峰值減低和在G2/M邊界，通過阻塞細(xì)胞來抑制有絲分裂節(jié)律。

這些共同的結(jié)果提示，cAMP水平被內(nèi)源性的時(shí)鐘控制，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期和周期性的雙峰的cAMP信號(hào)(由晝夜振蕩器開始或連同它)，可能參與細(xì)胞分裂周期活動(dòng)向晝夜周期特定相位安裝閘門。

9.細(xì)胞分裂周期的晝夜節(jié)律控制模型

為了細(xì)胞分裂周期與晝夜振蕩器的耦合，這些結(jié)果被納入了模型(圖7)。我們提議，在CT00-02時(shí)，cAMP激增會(huì)延遲DNA合成，在G2期在限制點(diǎn)保存細(xì)胞，在人工白天阻止細(xì)胞分裂。cAMP水平減低后，細(xì)胞從阻塞中釋放，Grieco 等已經(jīng)顯示這與MPF的酪氨酸-去磷酸化-誘導(dǎo)激活密切相關(guān)，G2/M轉(zhuǎn)變，或有絲分裂本身，在CT12-14時(shí)，由第二個(gè)cAMP峰值加速，結(jié)果有絲分裂被定相到人工黑夜。通過cPKA激活，人工夜晚中cPKB激活的有絲分裂刺激，引導(dǎo)人工白天中細(xì)胞分裂周期進(jìn)程的cAMP的延遲效應(yīng)。這些激酶中任何一個(gè)激活都會(huì)引起一組不同的目標(biāo)的磷酸化作用和干擾不同細(xì)胞周期控制的通路。在細(xì)胞分裂周期的不同階段可表達(dá)cPKA 和cPKB。作為一種選擇，這些酶的水平可顯示晝夜節(jié)律變化，人工白天時(shí)表達(dá)cPKA 和人工黑夜時(shí)表達(dá)cPKB。另一個(gè)可能性是，它們下游目標(biāo)振蕩中的一個(gè)水平，結(jié)果僅cPKA的激活在人工白天的細(xì)胞分裂周期進(jìn)程中有效應(yīng)， cPKB的激活在人工黑夜的細(xì)胞分裂周期進(jìn)程中有效應(yīng)。

在CT00-02時(shí)，cAMP激增延遲DNA合成(可能在G2期在限制點(diǎn)保存細(xì)胞) 在人工白天阻止細(xì)胞分裂。 cAMP水平減低后，細(xì)胞從阻塞中釋放, 有絲分裂本身在CT12-14時(shí)，由第二個(gè)cAMP峰值加速，結(jié)果有絲分裂被定相到人工黑夜。通過兩個(gè)cAMP依賴性激酶(cPKA, cPKB) 的活動(dòng)來解釋細(xì)胞周期進(jìn)程中cAMP的相反效應(yīng)，其在細(xì)胞分裂周期(或在晝夜周期的不同相位)的不同階段中表達(dá)以及其有不同目標(biāo)的配置。(摘自： Carré I, Edmunds Jr LN.J Cell Sci 1993; 104:1163-1173.? 1993 The Company of Biologists, Ltd.)圖7　細(xì)胞分裂周期的晝夜節(jié)律

10.與細(xì)胞周期蛋白振蕩器連接

通過(或者連同)我們已經(jīng)識(shí)別的AC-cAMP-PDE 系統(tǒng)和cAMP依賴性激酶(cPKA 與cPKB)，晝夜振蕩器最終是如何把調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期的MPF時(shí)鐘耦合在一起？ 最近，利用單克隆抗人clb1抗體蛋白，我們已經(jīng)做western blot細(xì)胞周期蛋白B分析(MPF調(diào)節(jié)亞基)，在CT00峰值與CT12波谷的晝夜周期和CDC里，從分裂的ZC細(xì)胞數(shù)量多樣化中發(fā)現(xiàn)了蛋白提取物同系物的豐度。然而，在靜止期細(xì)胞的不分裂相里，分裂細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白的這些晝夜節(jié)律波動(dòng)就會(huì)停止。

在連續(xù)黑夜，從ZC突變株中分裂的和靜止相細(xì)胞的蛋白提取物的初步western blot分析，證實(shí)p34cdc2同系物的存在，早期在其他藻類，野生型裸藻中報(bào)道過MPF的催化亞單位，提示貫穿細(xì)胞分裂周期，其豐度是不變的，當(dāng)細(xì)胞停止分裂，減少到很低的水平。還有，周期依賴方式的出現(xiàn)可觀察到單體電泳移動(dòng)的相對(duì)位移：一條更緩慢的移動(dòng)帶消失在CT09，在CT18時(shí)又出現(xiàn)。遷移率這種變化歸功于磷酸化與去磷酸化作用。很明顯，甚至靜止期細(xì)胞，cdc2的磷酸化節(jié)律以晝夜節(jié)律周期(τ=26小時(shí))持續(xù)著。 我們通過利用土豆酸性磷酸酶完全去磷酸化cdc2，然后用無抗-磷酸酪氨酸免疫反應(yīng)性的單條帶去跑，定性這些變化。這些最初的發(fā)現(xiàn)表明，多肽的活性取決于翻譯后的機(jī)制。

很多利用未經(jīng)處理的提取物最新結(jié)果已經(jīng)揭示了除了去磷酸化蛋白，兩種cdc2的磷酸化形式。這種更緩慢移動(dòng)(更多的磷酸化)的形式在人工白天中占優(yōu)勢(shì)，是通過抗磷酸酪氨酸認(rèn)可的唯一形式。在人工黑夜，這種更快移動(dòng)、較少磷酸化形式出現(xiàn)在更緩慢移動(dòng)形式減少的伴隨物中。事實(shí)上，這種更快移動(dòng)的缺乏酪氨酸磷酸化的磷酸化形式可能是蘇氨酸磷酸化，在其他物種是一樣的。然而到人工黑夜結(jié)束時(shí)，這種形式才消失，而更緩慢移動(dòng)形式的量，在這兩種殘留物中被磷酸化，人工黎明前會(huì)升高。我們得出結(jié)論，cdc2可逆的酪氨酸磷酸化是與晝夜振蕩器耦合在一起的。

最后我們注意到，Bjarnason 和 coworkers[7]已經(jīng)檢測(cè)到了在人類口腔黏膜和皮膚以及與特定的細(xì)胞分裂周期階段關(guān)聯(lián)中時(shí)鐘基因的晝夜節(jié)律表達(dá)。在一個(gè)用24小時(shí)時(shí)間間隔來做活組織檢查中，測(cè)定hClock,hTim,hPer1,hCry1和hBmal1的相對(duì)RNA表達(dá)的含量，發(fā)現(xiàn)其符合在嚙齒動(dòng)物的SCN和周邊組織中發(fā)現(xiàn)顯示晝夜節(jié)律輪廓。hPer1,hCry1和hBmal1是有節(jié)律性的，在清晨、午后和夜里分別達(dá)到峰值，而hClock,hTim無節(jié)律性。在合并的口腔黏膜活檢里，胸腺嘧啶核苷酸合成酶活性(DNA合成的標(biāo)記物)有晝夜節(jié)律改變，峰值在下午初期，符合S相位的定時(shí)。hPer1表達(dá)的主要峰值如同口腔黏膜G1期的峰值，在同一時(shí)間出現(xiàn)，暗示晝夜節(jié)律和哺乳動(dòng)物之間的聯(lián)系。類似地，伴著G1后期, G1/S期, G2期和M期各自出現(xiàn)的峰值，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂周期蛋白、p53、 細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白B1有節(jié)律地改變。同樣地，在一項(xiàng)68個(gè)老鼠肝臟再生的細(xì)胞分裂周期關(guān)聯(lián)基因的分析中，利用DNA微列陣和Northern blot技術(shù)，Matsuo等已經(jīng)顯示，晝夜節(jié)律時(shí)鐘直接控制wee1的表達(dá)，反過來調(diào)節(jié)活化的細(xì)胞周期蛋白B1-Cdc2激酶的表達(dá)和調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞的進(jìn)入。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于化療和放療時(shí)間的設(shè)置有重要的臨床意義，如同一份新近的研究報(bào)告所述，在小鼠的生理休息時(shí)間定量給藥，凋亡藥物比如多西他賽顯示最小毒性和最高抗腫瘤療效，另一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)提示晝夜節(jié)律時(shí)鐘能調(diào)整細(xì)胞分裂周期和凋亡過程(舉例說，凋亡BCL 2-關(guān)聯(lián)X蛋白的表達(dá))。

11.小結(jié)

從以上綜述可以清楚地看到，裸藻系統(tǒng)已經(jīng)給晝夜節(jié)律提供了極好的例子。除了20多年前主要綜述里引用的大數(shù)量例子[2]，許多新的不同行為的實(shí)例，生理生化活動(dòng)被一些試驗(yàn)室記錄沿著24小時(shí)軸線劃分。這些包括光捕獲葉綠素蛋白的晝夜節(jié)律變化、NAD+激酶和NADP+磷酸酶及線粒體鈣循環(huán)的影響，整個(gè)腺苷酸環(huán)化酶—cAMP—磷酸二酯酶通路(與細(xì)胞周期蛋白p34cdc2/CDC28通用的細(xì)胞分裂周期“引擎” 搭配)。裸藻無性別，故不適合諸如脈胞菌、果蠅和擬南芥這些模型系統(tǒng)所提供的遺傳解剖。但是在營(yíng)養(yǎng)模式中它有多功能的優(yōu)勢(shì)，便于培養(yǎng)以及同步化細(xì)胞分裂周期，因?yàn)槿~綠體艙的分解和對(duì)各種生理生化現(xiàn)象的貢獻(xiàn)而易獲得突變株。這些考慮能夠在已經(jīng)報(bào)道的晝夜節(jié)律時(shí)鐘試驗(yàn)研究中得到支持并能繼續(xù)研究做下去。盡管如此，今后仍需解決的問題是：應(yīng)構(gòu)建和完善豐富的不同物種的晝夜節(jié)律調(diào)控模型，進(jìn)一步揭示晝夜節(jié)律在哺乳動(dòng)物乃至人類生理活動(dòng)與生化代謝中的調(diào)控過程，最終為人類治療疾病和延長(zhǎng)壽命提供新的理論基礎(chǔ)。

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作者單位：1.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院檢驗(yàn)科5300212.北京醫(yī)院北京老年醫(yī)學(xué)研究所100730

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81061120527，81370445，81472408, 81400790)；衛(wèi)生部公益性研究基金(201302008)；

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2015.04.005

收稿日期：2015-6-27

The research of biont in Circadian rhythms and aging degenerative process(HEBenjin1,2,LIANGQinghua1,HUCaiyou1,SUNLiang2,ZHUXiaoquan2,YUANHuiping2,YANGFan2,LIXinghui2,QINJiaoqin1,2,JIAChunyuan2,HANJing2,DUJiancai2,ZHANGFandi2,YANGZe2.1.Departmentofclinicallaboratory,Jiangbinhospital,Nanning,Guangxi530021,China.2.InstituteofGeriatrics,MinistryofHealth,BeijingHospital,Beijing100730,China)*Correspondingauthor:LIANGqinghua,HUcaiyou.

【Abstract】Most organisms exhibit clear circadian rhythm based on 24h or approximately 24h cycle.Circadian rhythm controls the replacement of wakefulness and sleep,it also runs normally even in light or dark condition throughout the day.However,circadian rhythm is also free-running under the condition of no light,and the setting of illumination to the rhythm plays a key role.Whether the physiological and biological activities of monitoring the organisms will change,following the variation of the circadian rhythm by changes in temperature,subjective light or dark conditions.We review the variations of physiological and biological activities of cell division cycle, enzymatic activity and aromatic amino acid metabolism in Euglena gracilis Klebs under the change of temperature or illumination condition.

【Key words】Euglena gracilis Klebs, Circadian rhythm, Cell division cycle, Circadian oscillator

※為通訊作者