HSP27在調(diào)控人胃癌細胞系5-FU耐藥中的作用機制

宋榮峰張慧卿熊彥王艷華萬以葉

作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院

【摘要】目的探討熱休克蛋白27(HSP27)在調(diào)控人胃癌細胞系5-FU耐藥中的作用機制。方法培養(yǎng)人胃癌細胞株HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28，采用CCK法篩選5-FU敏感株和耐藥株，采用流式細胞儀和western blot 檢測4株胃癌細胞株中HSP27表達水平，轉(zhuǎn)染HSP27-siRNA，觀察siRNA干擾后5-FU敏感株和耐藥株中HSP27蛋白表達，并將兩細胞株分別與不同濃度5-Fu共培養(yǎng)，采用CCK法檢測細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果CCK法顯示SGC7901細胞系是4株胃癌細胞中5-Fu相對耐藥株，而HCG27是5-Fu相對敏感株。流式細胞儀顯示SGC7901細胞株中HSP27表達水平最高為 (72.10±1.89)%，而在HGC27細胞株中的表達水平最低為(22.12±1.33)%，各株表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染HSP27-siRNA 后，各兩株細胞HSP27蛋白表達水平均下降明顯。與5-Fu共培養(yǎng)后，SGC7901細胞株轉(zhuǎn)染組細胞半數(shù)抑制濃度降低，藥物敏感性增強，與未轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論HSP27參與了SGC7901 5-FU耐藥株中的細胞耐藥，是誘導(dǎo)細胞多藥耐藥的重要分子機制，可以作為臨床治療靶點來提高胃癌患者對化療的敏感性。

【關(guān)鍵詞】胃癌；5-FU；HSP27

基金項目：江西省衛(wèi)生廳一般科技項目(編號：20091213)

通訊作者：宋榮峰

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.003

中圖分類號：R735.2

收稿日期(2015-04-21修回日期 2015-08-03)

The Mechanism of HSP27 Regulation of 5-FU Resistant in Human Gastric

Cancer Cell Lines

SONGRongfeng,ZHANGHuiqing,XIONGYan，etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo investigate the mechanism of HSP27 of 5-FU resistant in human gastric cancer cell lines.MethodsHuman gastric cancer cell lines(HGC27,BGC823,SGC7901,MKN28)were cultured,and the cells which were resistant to 5-FU were selected by CCK assay and flow cytometry.The expression of HSP27 in these cells were detected by Western Blotting.And 2 cell lines were co-cultured with different concentration of 5-Fu,then the half inhibition concentration was detected by CCK assay.ResultsCCK assay showed that SGC7901 cell line was relatively resistant to 5-Fu,and the HCG27 cell line was relatively sensitive to 5-Fu.The flow cytometry results suggested that the expression of HSP27 in the SGC7901 cells was the highest(72.10±1.89)%.Nevertheless,it was the lowest in the HGC27 cells(22.12±1.33)%.After transfection by HSP27-siRNA,the expression levels of HSP27 in two cell lines was significant decreased (P<0.05);however,co-cultured with 5-Fu,the half inhibition concentration of SGC7901 cell lines was decreased,meanwhile the sensitivity to 5-Fu was enhanced.ConclusionHSP27 is involved in the 5-Fu resistance of SGC7901 cells,it induced an important molecular mechanism of multi-drug resistance and could be applied as a therapeutic target in order to increase the sensitivity of chemotherapy.

【Key words】Gastric cancer;5-FU;HSP27

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1430～1433)

在中國胃癌的發(fā)病率和死亡率居高不下，發(fā)病率位居第二，死亡率則為第三，是我國惡性腫瘤中危害最為嚴重的疾病之一。盡管隨著胃癌的診療水平不斷提高，但是大部分胃癌確診已屬晚期，失去手術(shù)機會，化療成為治療的主要手段[1]。氟尿嘧啶(5-FU)作為目前胃癌化療的基礎(chǔ)用藥，其耐藥性也越來越受到關(guān)注。有研究表明，HSP27在多種腫瘤特別是腺癌起源者中異常高表達，其高表達與腫瘤耐藥關(guān)系密切。研究證實，HSP27是結(jié)腸癌5-FU耐藥的新的調(diào)節(jié)子，但在胃癌細胞中未見相關(guān)研究報道[2]。本研究將探索HSP27在人胃癌細胞系5-FU耐藥中的調(diào)節(jié)作用，從而為逆轉(zhuǎn)胃癌5-FU耐藥的新途徑提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑

人胃癌細胞系HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所惠贈，RPMI1640細胞培養(yǎng)液(Gibco公司)，0.5%(質(zhì)量分數(shù))胰酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)(Gibco公司)，胎牛血清(Sigma公司)，Cell Counting Kit-8(日本，Dojindo) 兔抗人HSP27多克隆抗體購自Abcam 公司。

1.2細胞培養(yǎng)

HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMIl640培養(yǎng)基中，并置于5%CO2、37 ℃條件下的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.3細胞增殖的CCK檢測

將對數(shù)生長期的4株胃癌細胞經(jīng)0.5%胰酶消化，細胞計數(shù)，制成細胞懸液，將細胞濃度為1×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 ul進行培養(yǎng)，待細胞活性恢復(fù)，加入5-Fu，藥物濃度為0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、 10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L，每個濃度設(shè)計3復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，于每孔加入10 μl的CCK-8，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，測定450 nm波長吸光度值，繪制細胞生長曲線，實驗重復(fù)3次。

1.4流式細胞儀檢測HSP27的表達

取對數(shù)生長期的HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌細胞，PBS洗凈后分別加入FITC標記的P-gp抗體40 μl，混勻，避光，4 ℃孵育30 min。PBS終止反應(yīng)，離心1 000 r/min，4 ℃ 離心5 min，棄上清，PBS洗2次。流式細胞儀檢測FITC熒光強度，Cell-quest軟件進行5-Fu耐藥株、5-Fu敏感株的HSP27表達分析。

1.5siRNA干擾和細胞轉(zhuǎn)染

HSP siRNA由上海生工合成，HSP siRNA序列(5'-UAGCCAUGCUCGUCCUGCCUU-3′)。應(yīng)用Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染劑并按照說明書進行轉(zhuǎn)染。將2×104cells/ml的耐藥株胃癌細胞SGC-7901和敏感細胞株HCG27分別接種于6孔板，每株胃癌細胞分為3組：空白對照組、轉(zhuǎn)染Lipofectamine組、轉(zhuǎn)染HSP-siRNA組，在37 ℃、50 ml條件下孵育，孵育4 h，24 h收集細胞。

1.6Western bolt檢測轉(zhuǎn)染后siRNA干擾后胃癌細胞中HSP蛋白的表達

分別收集3組經(jīng)處理的耐藥株及敏感株胃癌細胞(1×107)：空白對照組(Non-control)、轉(zhuǎn)染Lipofectamine組(Li-control)及轉(zhuǎn)染HSP-siRNA組(siRNA group),加入適量含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液RIPA。離心12 000 rpm 4 ℃ 10 min，取上清，BCA 法蛋白定量。計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜(Millipore公司產(chǎn)品)后封閉,加入一抗(HSP抗體,P-pg抗體,Santa C ruz公司產(chǎn)品)4 ℃孵育過夜,加入二抗(辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG,Zymed 公司產(chǎn)品)室溫下孵育1～2 h；ECL顯影，暗室中X 光膠片曝光1 min或5 min，放入沖片機沖洗。膠片掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。以曝光條帶的強弱分析HSP27蛋白表達的高低。同時設(shè)立β-actin(Santa C ruz公司產(chǎn)品)為內(nèi)對照。

2結(jié)果

2.1CCK檢測5-Fu對不同胃癌細胞株生長的抑制作用

不同濃度的5-Fu(0 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L)分別用于作用HGC27、BGC823、SGC7901、MKN28 4株胃癌細胞72 h，通過繪制生長曲線圖(圖1)，發(fā)現(xiàn)5-Fu對4株胃癌細胞的生長都具有抑制作用，其中對HGC27的抑制效果最顯著，IC50為5.85 mg/L；對SGC7901抑制率最低，為17.00 mg/L。

圖1　CCK檢測5-Fu對不同胃癌細胞株生長的抑制情況

2.2流式細胞儀檢測4株胃癌細胞株中HSP27蛋白表達情況

流式細胞儀檢測結(jié)果表明，4株胃癌細胞株中HSP27表達水平各不相同，在SGC7901中表達水平最為顯著為 (72.10±1.89)%，BGC823為(63.92±2.94)%，MKN28中的表達水平為(45.40±2.62)%，在HGC27中的表達水平為(22.12±1.33)%，顯著低于5-Fu耐藥株SGC7901中HSP27的表達水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)(圖2)。

圖2　流式細胞儀檢測4株胃癌細胞株中HSP27蛋白表達情況

2.3Western bolt檢測siRNA干擾后5-Fu胃癌耐藥株與敏感株中HSP27的表達

根據(jù)CCK檢測結(jié)果，SGC7901細胞株是4株胃癌細胞中5-Fu相對耐藥株，而HCG27是5-Fu相對敏感株，選擇SGC7901及HCG27胃癌細胞系作為HSP27 siRNA干擾細胞株，Westerb blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾后細胞株SGC7901和HCG27中HSP27蛋白表達水平均明顯下降，灰度掃描顯示相對比值分別為(1.375±0.301)和(1.259±0.289)，見圖3、圖4。

N：空白對照組，C：Lipofectamine轉(zhuǎn)染組，SiRNA:siRNA干擾組

N：空白對照組，C：Lipofectamine轉(zhuǎn)染組，SiRNA:siRNA干擾組

2.4干擾前后SGC7901及HCG27細胞對5-FU敏感性的變化

轉(zhuǎn)染24 h后，與5-Fu共培養(yǎng)后，未轉(zhuǎn)染組SGC7901 和 HGC27的IC50分別為17.24 mg/L和5.78 mg/L，轉(zhuǎn)染組細胞IC50分別為8.54 mg/L和5.12 mg/L，耐藥株SGC7901細胞的半數(shù)抑制濃度明顯降低，藥物敏感性增強，與未轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

圖5　3組SGC7901細胞株的對5-FU敏感性的變化

3討論

熱休克蛋白27是小分子熱休克蛋白家族的醫(yī)院，其具有保護機體生理細胞免受熱、毒物、缺氧、自由基等損傷的作用，可促進蛋白質(zhì)的正確組裝和糾正錯誤的蛋白結(jié)構(gòu)，具有分子伴侶的作用[3-5]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，HSP27參與了腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為，包括促進細胞的增生、分化和抑制腫瘤細胞的凋亡等，具有調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[6]，HSP27在多種惡性腫瘤中高表達，且與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌等患者的預(yù)后密切相關(guān)[7-10]。目前，國內(nèi)臨床上治療惡性腫瘤的主要措施為化療和根治性手術(shù)治療等，術(shù)前常規(guī)化療可有效縮小腫瘤體積，提高手術(shù)的成功率，但部分患者對化療藥物順鉑、5-FU等具有耐藥性，國外有學(xué)者通過將HSP27 cDNA轉(zhuǎn)染小鼠，獲得高表達HSP細胞后發(fā)現(xiàn)其對順鉑等具有高抵抗能力[11]。國內(nèi)學(xué)者研究也發(fā)現(xiàn)，高表達HSP的腫瘤細胞株對阿霉素具有較高的抵抗作用。大量實驗證實了HSP27高表達與腫瘤的化療耐藥等密切相關(guān)[12-15]。因此，本研究將探索HSP27在人胃癌細胞系5-FU耐藥中的調(diào)節(jié)作用，從而為逆轉(zhuǎn)胃癌5-FU耐藥的新途徑提供理論依據(jù)。

本研究通過篩選5-FU胃癌細胞株耐藥株和敏感株，采用siRNA干擾技術(shù)，沉默細胞內(nèi)HSP27的表達，并與5-FU共培養(yǎng)后關(guān)系細胞的半數(shù)抑制濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA干擾后細胞內(nèi)HSP蛋白表達下降，表明RNA干擾技術(shù)成功沉默了HSP27的表達，而與5-FU共培養(yǎng)后，胃癌細胞耐藥株SGC7901對5-FU的敏感性增強，半數(shù)抑制濃度降低，表明HSP27可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)胃癌細胞對5-FU的耐藥，增強了維系細胞對5-FU的敏感性。上述結(jié)果表明，胃癌細胞內(nèi)HSP27的表達水平與細胞對化療藥物的敏感性密切相關(guān)，HSP27將可作為臨床治療的新靶點。

目前關(guān)于HSP27誘導(dǎo)胃癌細胞化療耐藥的機制研究不多，尚無明確結(jié)論，化療藥物5-FU主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤生長的作用[16]。大量研究表明，HSP27可以特異性干擾線粒體途徑的胱天蛋白水解酶誘導(dǎo)的凋亡，并可與凋亡蛋白Caspase3結(jié)合，而Caspase3 可通過裂解底物PARP使細胞損失對DNA損傷的修復(fù)功能，促進凋亡的發(fā)生，當HSP27與后者結(jié)合后，抑制了凋亡，從而促進了細胞的生長[17-20]，通過從機制上進一步研究HSP27參與腫瘤化療耐藥的可能機制，才能更好地干擾HSP27的表達，為臨床提供理論依據(jù)。

參考文獻

[1]YamamotoK,Isonishi S,Ohtake Y,et al.Heat shock protein 27 was up-regulated in cisplatin resistant human ovarian tumor cell line and associated with the cisplatin resistance〔J〕.Cancer Lett,2001,168(2):173-181.

[2]GOBBO J,GAUCHER-DI-STASIO C,WEIDMANN S,et al.Quantification of HSP27 and HSP70 molecular chaperone activities〔J〕.Molecular Chaperones.Humana Press,2011,787:137-143.

[3]KATO K,ADACHI S,MATSUSHIMA-NISHIWAKI R,et al.Regulation by heat shock protein 27 of osteocalcin synthesis inosteoblasts〔J〕.Endocrinology,2011,152(5):1872-1882.

[4]郭劍偉，李杰.胃癌的化療耐藥性研究進展〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2002，29(4)：323-325.

[5]Berrieman HK,Smith L,Lind MJ,et al.Hsp27 may allow prediction of the response to single-agent vinorelbine chemotherapy in non small cell lung cancer〔J〕.Oncol Rep,2006,15(1):283-286.

[6]LEE JH,Lee JS,Lee JH,et al.Overexpression of human 27 kDa heat shock protein in laryngeal cancer cells confers chemo-resistance associated with cell growth delay〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2007,133(1):37-46.

[7]孫雪峰，朱易凡.人胃癌細胞中HSP27高表達與長春新堿耐藥的關(guān)系〔J〕.重慶醫(yī)學(xué)，2012,41(30)：3194-3198.

[8]HAYASHI N,PEACOCK JW,BERALDI E,et al.Hsp27 silencing coordinately inhibits proliferation and promotes Fas-induced apoptosis by regulating the PEA-15 molecular switch〔J〕.Cell Death Differ,2011,19(6):990-1002.

[9]ZHAO M,SHEN F,YIN YX,et al.Increased expression of heat shock protein 27 correlates with peritoneal metastasis in epithelial ovarian cancer〔J〕.Reproductive Sciences,2012,19(7):748-753.

[10]HSU HS,LIN JH,HUANG WC,et al.Chemoresistance of lung cancer stemlike cells depends on activation of Hsp27〔J〕.Cancer,2011,117(7):1516-1528.

[11]李海燕，王常玉.HSP27在卵巢癌順鉑耐藥細胞系中的作用〔J〕.腫瘤防治研究，2011,38(11)：1219-1228.

[12]Rane MJ,McLeish KR,Klein JB,et al.Heat shock protein 27 controls apoptosis byregulatingAkt activation〔J〕.J Biol Chem,2003,278(30):27828-27835.

[13]Musiani D,Konda JD,Pavan S,et al.Heat-shock protein 27 (HSP27,HSPB1)is up-regulated by MET kinase inhibitors and confers resistance to MET-targeted therapy〔J〕.FASEB J，2014,28(9):4055-4067.

[14]Leal MF,Chung J,Calcagno DQ,et al.Differential proteomic analysis of noncardia gastric cancer from individuals of northern Brazil〔J〕.PLoS One，2012，7(7):e42255.

[15]Oya-Ito T,Naito Y,Takagi T,et al.Heat-shock protein 27 (Hsp27)as a target of methylglyoxal in gastrointestinal cancer〔J〕.Biochim Biophys Acta，2011,1812(7):769-781.

[16]Ock CY,Lim YJ,Kim YJ,et al.Acid pump antagonist-provoked HSP27 dephosphorylation and accentuation rescues stomach from indomethacin-induced damages〔J〕.J Dig Dis，2011,12(2):71-81.

[17]Ciocca DR,Calderwood SK.Heat shock proteins in cancer:diagnostic,prognostic,predictive,and treatment implications〔J〕.Cell Stress Chaperones，2005,10(2):86-103.

[18]Fukagawa Y,Nishikawa J,Kuramitsu Y,et al.Epstein-Barr virus upregulates phosphorylated heat shock protein 27 kDa in carcinoma cells using the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway〔J〕.Electrophoresis，2008,29(15):3192-3200.

[19]Giaginis C,Daskalopoulou SS,Vgenopoulou S,et al.Heat Shock Protein-27,-60 and-90 expression in gastric cancer:association with clinicopathological variables and patient survival〔J〕.BMC Gastroenterol，2009,9:14.

[20]Rashmi R,Kumar S,Karunagaran D,et al.Ectopic expression of Hsp70 confers resistance and silencing its expression sensitizes human colon cancer cells to curcumin-induced apoptosis〔J〕.Carcinogenesis，2004,25(2):179-187.

(編輯：甘艷)