·基礎(chǔ)研究·

單次與分次劑量照射大鼠放射性肺損傷模型的建立

潘純國劉智華王靜怡朱根華嚴志宏王小平黃傳生

作者單位:330029 江西省腫瘤醫(yī)院(潘純國，劉智華，王靜怡，王小平，黃傳生)；330004 江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室(朱根華，嚴志宏)

【摘要】目的建立單次與分次劑量分割模式照射的放射性肺損傷動物模型，評價兩種造模方法的可行性、科學性及實用性。方法85只大鼠隨機分為對照組(A組15只)、單次照射組(B組35只)、分次照射組(C組35只)。A組洋裝照射，B組(照射1次，15 Gy)及C組(3 Gy/次，每周照射2次，共6次)均采用6MV X線照射大鼠雙肺，于照射后第1、3、5、8、12周隨機處死大鼠留取血液3～5 ml，采用ELISA法測定血清TGF-β1含量。取右肺中葉組織，HE染色動態(tài)觀察各組大鼠肺組織損傷的病理變化，行免疫組化染色，測定肺組織中TGF-β1的表達。結(jié)果照射后B組死亡7只，C組死亡1只。B組及C組大鼠肺組織均表現(xiàn)有急性炎癥期、增生期及纖維化期的放射性肺損傷的典型病變過程，血清TGF-β1含量依順序時相點逐漸升高，于第12周達峰值，均顯著高于A組(P<0.05)，B組稍高于C組，比較無差異。B組及C組TGF-β1陽性表達率依順序時相點逐漸升高，于第12周達到最高表達率，與A組比較有顯著差異，B組稍高于C組，比較無差異。結(jié)論兩種分割照射方式均成功建立了放射性肺損傷動物模型，可行性好，分次照射適合長期試驗研究。

【關(guān)鍵詞】放射性肺損傷；動物模型；大鼠；TGF-β1

基金項目：江西省科技支撐計劃(編號：2011BBG70062)

通訊作者：劉智華

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.10.001

中圖分類號：R73-36

收稿日期(2015-04-04修回日期 2015-05-21)

Establishment of Irradiation Induced Lung Injury in Rats Model Underwent

Single and Fractional Irradiation

PANChunguo,LIUZhihua,WANGJingyi,etal.JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Abstract【】ObjectiveTo establish irradiation induced lung injury in rats model underwent single and fractional irradiation,and to evaluate the feasibility,scientificity and practicability of 2 models.Methods85 rats were randomly divided into the control group(group A,15rats received sham irradiation),single irradiation group(group B,35 rats received 15 Gy to their thoraxes with 6 MV X-ray)and fractional irradiation group(group C,35 rats received 18 Gy to their thoraxes with 6 MV X-ray,3 Gy per fraction,2 fraction per week).After radiation,the rats were killed at 1,3,5,8,12 week,the TGF-β1 of serum were measured by ELISA.All middle lobes of right lungs were obtained for pathological observation and expression of TGF-β1was detected by immunohistochemistry.Results7 and 1 rats died in group B and group C after irradiation.Group B and group C's lung had a typical changes of radioactive lung injury,including acute inflammation,hyperplasia and fibrosis,TGF-β1 in blood serum increased along with the time sequence after irradiation,and reached the highest level at 12th week.Group B was slightly higher than group C,there was no significant difference between the 2 groups.Group B and group C were higher than group A(P<0.05).Positive expression rate of TGF-β1 increased along with the time sequence after irradiation,and reached the highest level at 12th week.Group B was slightly higher than group C,there was no significant difference between the 2 groups.Group B and group C were higher than group A(P<0.05).ConclusionThe animal model of radiation-induced lung injury is established through the 2 types of irradiation,it is feasible,and the model by fractional irradiation is suitable for the long-term experimental study.

【Key words】Radiation-induced lung injury;Animal model;Mice;TGF-β1

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1423～1425)

不同程度放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療后常見的并發(fā)癥，限制了胸部腫瘤放療劑量提升致腫瘤控制率下降，同時嚴重影響患者生存質(zhì)量[1]，嚴重者成為非腫瘤致死因素。盡管近年來放療設(shè)備不斷更新及放射技術(shù)不斷完善，但放射性肺損傷發(fā)生率仍然較高[2-3]且缺乏有效治療措施，因此放射性肺損傷一直成為研究的焦點之一。本研究擬采用單次大劑量和分次照射大鼠雙肺，通過比較照射后肺組織動態(tài)病理變化、肺組織TGF-β1表達、血清TGF-β1含量測定，為研究放射性肺損傷提供可靠的大鼠動物模型。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

健康SD大鼠85只，照射前后均飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學教育部重點實驗室，隨機抽簽分為對照組15只(A組)、單次照射組35只(B組)、分次照射組35只(C組)。

1.2照射方法

速眠新Ⅱ1 ml肌肉(腹腔)全身麻醉后，5只大鼠并排仰臥固定于自制老鼠板上，在X線模擬機下確定照射野(雙肺照射)：上界為肺尖，下界為肋膈角，左右漏空，射野大小一般為4.5 cm×20 cm。采用西門子Primus高能直線加速器6MV X線進行垂直照射，放置2 cm厚補償膜，源皮距100 cm，深度3.5 cm，劑量率3 Gy/min，A組大鼠麻醉后佯裝照射,B組大鼠單次照射(15 Gy)，C組大鼠分次照射(3 Gy/次，2次/周×3周)。

1.3取材及處理

于照射后第1、3、5、8、12周末5個時相點隨機活殺A組大鼠3只、B組及C組大鼠各7只，經(jīng)股動脈留取大鼠血液3～5 ml，4 ℃下靜置待凝固后3 500轉(zhuǎn)/分，離心5 min取上清貯存于-70 ℃冰柜內(nèi)備用。剖開胸腔分離主支氣管，快速將氣管及雙肺剝離出胸腔，觀察肺的大體結(jié)構(gòu)改變。選取右肺中葉組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，HE常規(guī)染色比較觀察各組肺組織病理組織結(jié)構(gòu)改變。采用免疫組化法檢測肺組織TGF-β1表達。

1.4免疫組化結(jié)果判斷標準

陰性(-)：胞質(zhì)中無顆粒沉著；弱陽性(+)：胞質(zhì)中淡黃色細顆粒沉著；陽性(++)：胞質(zhì)中棕黃色顆粒沉著；強陽性(+++)：胞質(zhì)中褐黃色粗顆粒沉著。陰性和弱陽性歸為陰性結(jié)果；陽性和強陽性歸為陽性結(jié)果。

1.5血清TGF-β1含量測定

備用大鼠血清在室溫下融化后2 h內(nèi)采用ELISA法測量TGF-β1含量(ng/ml)，測量試劑盒由美國ADL公司生產(chǎn)，操作步驟嚴格按說明書要求進行。

1.6統(tǒng)計軟件和方法

應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間陽性率計數(shù)資料比較采用配對χ2檢驗，P<0.05時被認為有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

實驗期間，共有8只大鼠死亡，其中A組無死亡，B組7只，C組1只，最早死亡發(fā)生在照射后3周，死亡集中在3～8周之間，死亡大鼠同樣取右中肺組織。B組大鼠在照射后精神差、活動少、體重下降，C組大鼠照射后在精神、活動及體重方面與照射前變化不明顯。

2.1肺大體標本觀察

各時間點A組大鼠肺表面均光滑，呈粉紅色，彈性良好。B組、C組大鼠于照射后第1周肺組織稍有腫脹，表面見少量散在點狀出血；B組、C組大鼠分別于照射第3周、5周后肺的顏色由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色，顏色進行性加深，且肺組織有腫脹。B組大鼠照射后第8周、第12周肺體積明顯縮小，表面呈灰白色，可見凹凸不平結(jié)節(jié)，質(zhì)地硬，彈性明顯降低，而C組大鼠于照射后第12周出現(xiàn)上述外觀改變。

2.2HE染色組織學觀察

A組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄而光滑，血管正常，肺泡腔完整，腔內(nèi)無滲出物。B組大鼠照射后第1、3周及C組大鼠照射后第3、5周可見肺泡充氣不良，肺泡壁輕度水腫，毛細血管充血，肺泡腔內(nèi)可見少量滲出及較多中性粒細胞浸潤，間隔無明顯滲出、充血和水腫。B組大鼠照射后第3、5周及C組大鼠照射后第5、8周可見肺泡間隔增寬，肺泡間隔及部分肺泡腔內(nèi)可見纖維素樣的滲出物及大量單核巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，肺組織中可見散在的體積縮小變圓、胞質(zhì)紅染、胞核固縮藍染似凋亡的細胞，與壞死的細胞較難區(qū)別。B組大鼠照射后第8、12周可見肺泡間隔進一步增寬，肺泡間隔破壞，可見到由梭形成纖維細胞構(gòu)成的成纖維病灶，膠原纖維呈帶狀，大部分肺泡腔塌陷、不張。肺內(nèi)病變輕重不一，可見肺實變，C組大鼠僅于照射后第12周出現(xiàn)上述改變。

2.3各組大鼠血清TGF-β1含量比較

A組大鼠血清TGF-β1含量在各時相點平穩(wěn)，B組及C組大鼠血清TGF-β1含量依順序時相點持續(xù)升高，于第12周達峰值，均顯著高于A組(P<0.05)，B組稍高于C組，比較無差異(圖1)。

2.4各組大鼠肺組織TGF-β1免疫組化結(jié)果比較

A組大鼠肺組織TGF-β1表達分別在第3周及第8周出現(xiàn)1只陽性。而B組及C組各時相點大鼠肺組織TGF-β1表達陽性表達數(shù)目從第1周至第12周均呈上升趨勢(圖2)。A組與B組及C組大鼠肺組織各時相點TGF-β1表達陽性率比較均有顯著性差異(表1)，B組與C組大鼠肺組織各時相點TGF-β1表達陽性率比較，差異無顯著性。

圖1　不同時相點三組血清TGF-β1含量曲線點

圖2　各組大鼠肺組織各時相點TGF-β1表達陽性數(shù)目

時間A(n=15)B(n=35)C(n=35)第1周0/3(0)4/7(57.14)a3/7(42.86)a第3周1/3(33.33)5/7(71.43)a3/7(57.14)a第5周0/3(0)5/7(71.43)a4/7(57.14)a第8周1/3(33.33)5/7(71.43)a5/7(71.43)a第12周0/3(0)7/7(100.00)a5/7(71.43)a

與A組比較，a為P<0.05；B組與C組比較，P>0.05。

3討論

放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療常見的并發(fā)癥，是影響患者放療的主要劑量限制性因素[4]，目前臨床上缺乏有效的防治措施，因此放射性肺損傷防治研究是醫(yī)學研究的熱點領(lǐng)域之一。成功建立動物放射性肺損傷模型是研究防治放射性肺損傷關(guān)鍵的第一步，陸忠華等[5]在建立小鼠放射性肺損傷模型研究中，以肺大體標本變化、染色組織學檢查及肺組織TGF-β1含量等作為鑒定指標，成功復制出了典型的放射性肺損傷小鼠動物模型。

另外不乏建立放射性肺損傷模型的研究[6-8]，但鮮有采用與臨床放射治療相似的分次分割照射方式建立放射性肺損傷模型的研究。本研究試圖以兩種分割方式照射大鼠雙肺建立放射性肺損傷動物模型，合理評估兩種分割照射方式建立放射性肺損傷動物模型的可行性、科學性及實用性。

本研究中，在照射大鼠雙肺后，以肺大體標本變化、HE染色組織學檢查及肺組織TGF-β1表達、血清TGF-β1含量進行放射性肺損傷的鑒定。結(jié)果顯示，通過大體標本觀察及HE染色組織學檢查，單次照射組和分次照射組大鼠肺組織學改變均經(jīng)歷一個不能完全分開的連續(xù)過程，分別為急性炎癥期(肺泡壁水腫，毛細血管充血，肺泡腔內(nèi)可見滲出液)、增生期(肺泡間隔增寬，肺泡間隔及部分肺泡腔內(nèi)見纖維素樣滲出物及單核巨噬細胞)及纖維化期(肺泡間隔進一步增寬并破壞，見由梭形成纖維細胞構(gòu)成的成纖維病灶，膠原纖維呈帶狀，肺泡塌陷、不張)，與國內(nèi)外[9-10]研究得出的放射性肺損傷病變規(guī)律和特點一致。TGF-β1廣泛存在機體各組織中，可抑制實質(zhì)細胞的增值，促進纖維母細胞和成骨細胞增值，刺激細胞增加基質(zhì)合成、減少基質(zhì)降解[11]。動物試驗和臨床觀察資料提示胸部腫瘤放療后TGF-β1的變化和放射性損傷的發(fā)生明顯相關(guān)，均證明TGF-β1在放射性損傷發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[12-13]。故通過檢測肺組織TGF-β1表達水平及其血清含量可反映放射性肺損傷的發(fā)生及程度。本研究結(jié)果顯示，B組和C組大鼠雙肺照射后，肺組織TGF-β1陽性表達率及血清TGF-β1含量依順序時相點逐漸升高，于第12周達到最高峰，與A組各相應(yīng)時相點結(jié)果比較有顯著差異，單次照射組稍高于分次照射組，比較無差異。且血清TGF-β1含量絕對數(shù)值與各時相點放射性肺損傷嚴重程度相對應(yīng)。病理免疫組化和TGF-β1檢測結(jié)果均提示單次照射方式和分次照射方式均成功建立了放射性肺損傷動物模型。

對放射性肺損傷穩(wěn)定性進行分析，分次照射組、對照組存活率分別為97%(34/35)、100%，明顯高于單次照射組存活率(80%)，分次照射建立的放射性肺損傷動物模型利于較為長期的實驗觀察，對實驗結(jié)果影響小。

綜上所述，單次及分次照射大鼠肺組織均能建立可靠的放射性肺損傷動物模型，符合病變規(guī)律及特點。大鼠全肺照射野容易控制，單次照射簡單，不影響臨床工作，可用于短期試驗研究；分次照射更符合臨床放療常規(guī)分割，死亡率低，可行性良好，分次照射利于長期試驗研究。

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(編輯：吳小紅)