葛菁萍， 裴芳藝， 黃守鋒， 趙靖雯， 宋 剛， 孫紅兵， 洛 雪， 平文祥，2*

(1.黑龍江大學生命科學學院 微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業(yè)微生物技術教育工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500)

?

木糖醇脫氫酶基因高拷貝表達載體構建及在釀酒酵母中的表達

葛菁萍1， 裴芳藝1， 黃守鋒1， 趙靖雯1， 宋 剛1， 孫紅兵1， 洛 雪1， 平文祥1，2*

(1.黑龍江大學生命科學學院 微生物省高校重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150080；2.農業(yè)微生物技術教育工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150500)

木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH)可以氧化木糖醇生成木酮糖，處于木糖代謝的節(jié)點位置。利用PCR方法克隆得到了休哈塔假絲酵母(Candidashehatae) 20335的木糖醇脫氫酶基因、質粒pKT0150的ADH1終止子序列和G418抗性基因(KanR)，以及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) W5特定的2.2 kb的rDNA片段。以釀酒酵母整合載體p406ADH1為骨架，利用基因工程手段構建一個多拷貝整合表達載體pLX-AGRX。將重組載體pLX-AGRX線性化轉入到釀酒酵母W5后，通過高濃度G418篩選和PCR雙重鑒定，證實重組載體pLX-AGRX已整合到釀酒酵母W5基因組上，測定木糖醇脫氫酶酶活可達65.957 4 U/mg。

休哈塔假絲酵母；木糖醇；木糖醇脫氫酶；載體構建；釀酒酵母

木質纖維素是豐富的可再生資源，廣泛存在于工農業(yè)的廢棄物中[1]。木質纖維素原料經(jīng)預處理和水解會生成大量的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖[2]，因此，廉價且儲量豐富的木質纖維素類生物質不僅可以作為生產燃料乙醇的底物，解決當前能源危機和環(huán)境污染等問題[3]，而且還可以利用其水解產物中的木糖，進行木糖醇和木酮糖的生產[4-5]。木糖是半纖維素水解液中除葡萄糖外的另一種主要成分，最高可占半纖維素水解糖類的34%[6]，但是自然界中的微生物普遍對木糖的利用率較低[2]，因此提高木糖的生物轉化率，可促進對半纖維素水解液的利用，從而實現(xiàn)對木質纖維素原料的全糖利用。以工業(yè)生產乙醇的菌株釀酒酵母Saccharomycescerevisiae為例，雖然具有許多優(yōu)良特性[7]，但其缺乏將木糖轉化為木酮糖(xylulose)的關鍵酶系，即木糖還原酶(xylose reudetase, XR)和木糖醇脫氫酶，因而不能利用木糖[8-9]。其中，木糖還原酶可以還原木糖生成木糖醇(xylitol)，木糖醇脫氫酶進而可以氧化木糖醇生成木酮糖[10-13]。木糖醇和木酮糖被定義為稀有糖，廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領域[14]。因此，利用基因工程手段將木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因克隆進入釀酒酵母體內，可以實現(xiàn)以木質纖維素為原料，生產木糖醇和木酮糖。本研究是從休哈塔假絲酵母(Candidashehatae) 20335中克隆木糖醇脫氫酶基因(xyl2)，以整合載體p406ADH1為骨架，在其中引入G418抗性基因KanR作為顯性選擇標記，以釀酒酵母同源的rDNA基因為整合位點，提高該整合質粒的拷貝數(shù)，同時引入釀酒酵母強啟動子ADH1序列及其終止子序列，用于提高目的基因xyl2的表達量，最終構建一個高拷貝高效表達木糖醇脫氫酶活力的整合表達載體。本研究為改造釀酒酵母特性，使其可以充分利用半纖維素水解液中的木糖成分，并轉化生成木糖醇及木酮糖提供了基因基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質粒 大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α，釀酒酵母菌株(Saccharomycescerevisiae) W5，休哈塔假絲酵母(Candidashehatae) 20335由本實驗室保存。質粒pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司，載體構建骨架pKT0150和質粒p406ADH1購自Addgene公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基，用于E.coli的培養(yǎng)；YPD液體培養(yǎng)基，用于C.shehatae和S.cerevisiae的培養(yǎng)。

1.1.3 酶和主要試劑盒 EasyPfu DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；限制性核酸內切酶KpnI、XhoI、NdeI、XbaI、HpaI購自寶生物工程有限公司；T4 DNA連接酶購自寶生物工程有限公司。YeastBusterTM酵母蛋白抽提試劑盒購自Novagen公司；真菌DNA提取試劑盒(目錄號60304-50)購自綿陽高新區(qū)天澤基因工程有限公司；柱式膠回收試劑盒(目錄號DP208/209)及柱式小量質粒抽提試劑盒(目錄號W5001)均購自上海華舜生物技術有限公司；DNA純化試劑盒購自Promege公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參照GenBank中已登陸的熱帶假絲酵母(Candidatropicali，序列號：DQ220745)和樹干畢赤酵母(Pichiastipitis,序列號：NC009068)的xyl2基因序列，設計xyl2-up、xyl2-down簡并引物對，用于克隆xyl2基因全長。另設計3對引物分別用于擴增G418抗性基因KanR、ADH1終止子片段及2.2 kb rDNA片段，在各上下游引物中分別加入用于質粒構建所需的酶切位點，同時在5′端加入保護堿基，各限制性內切酶位點為構建元件定向克隆到構建骨架質粒載體p406ADH1而設計。各引物序列見表1。

表1 引物序列及所加入的酶切位點

注：“+”為上游引物，“-”為下游引物；加下劃線部分為酶切位點序列

1.2.2 各構建元件的克隆 利用設計的4對引物，按以下各反應程序PCR擴增重組質粒載體構建所需的4個元件片段(表2)。得到的各基因片段與載體pMD18-T連接后轉化E.coliDH5α，經(jīng)PCR篩選鑒定陽性重組質粒，并分別命名為pLXT-A、pLXT-G、pLXT-R、pLXT-X。陽性重組質粒的測序由Invitrogen公司完成。

表2 4個克隆元件的PCR反應程序及相關參數(shù)

1.2.3 高拷貝整合表達載體pLX-AGRX的構建 將重組載體pLXT-A和表達載體p406ADH1用XhoI和KpnI進行雙酶切后連接，構建重組表達載體pLX-A。將重組載體pLXT-G和上步構建表達載體pLX-A用NdeI和KpnⅠ進行雙酶切后連接，構建重組表達載體pLX-AG。將重組載體pLXT-R和上步構建表達載體pLX-AG用NdeI單酶切后連接，構建重組表達載體pLX-AGR。將重組載體pLXT-X和上步構建表達載體pLX-AGR用XhoI和XbaI進行雙酶切后連接，構建重組表達載體pLX-AGRX。將以上構建得到的質粒載體轉化E.coliDH5α，提取質粒pLX-AGRX，采用酶切和PCR方法鑒定陽性克隆并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組質粒載體轉化釀酒酵母 重組質粒pLX-AGRX用限制性內切酶HpaI進行單酶切線性化后，用醋酸鋰法轉化法對釀酒酵母W5進行轉化。HpaI的單酶切位點位于特定2.2 kb rDNA片段的中部，重組質粒載體經(jīng)該酶線性化后可以特異整合到釀酒酵母染色體的特定部位，以實現(xiàn)多拷貝同源重組。

1.2.5 重組釀酒酵母的篩選與鑒定 用含200 μg/mL(即G418對釀酒酵母W5的最低抑菌濃度)G418的YPD平板篩選陽性重組菌，當篩選平板上長出陽性重組菌后，挑選出長勢較好的菌落，接種在更高濃度的G418平板上，通過提高G418濃度以篩選高拷貝的整合轉化子。同時對經(jīng)篩選得到的高拷貝轉化子提取基因組DNA，通過PCR驗證確定重組質粒載體是否已經(jīng)整合到釀酒酵母的染色體上。

1.2.6 木糖醇脫氫酶酶活測定 采用考馬斯亮藍G-250染色的方法測定蛋白質濃度，粗酶液的制備采用Novagen公司的YeastBusterTM酵母專用蛋白抽提試劑盒，提取液作為粗酶液進行木糖醇脫氫酶酶活測定。木糖醇脫氫酶酶活為以l mL反應液在340 nm下檢測NAD+被還原的量(即在340 nm做時間掃描)。酶的比活力定義為每mg酶蛋白，每分鐘轉化NAD+的μmol/L數(shù)即U/mg蛋白。

1.2.7 重組菌的穩(wěn)定性測定 將篩選得到的高拷貝陽性酵母轉化子接種于YPD液體培養(yǎng)基中，每隔12 h取樣，系列稀釋，以能在平板上長出單菌落為宜，分別在YPD和含G418的YPD平板上菌落計數(shù)，分別計為總菌數(shù)和帶有整合質粒的菌落數(shù)，計算質粒載體穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 重組T載體的構建

將所得ADH1終止子片段(283 bp)、G418抗性基因(1 457 bp)、rDNA序列、xyl2基因(1 095 bp)分別與pMD18-T載體連接后，轉化E.coliDH5α，經(jīng)PCR鑒定正確，進行測序，得到構建成功的4個重組T載體：pLXT-A、pLXT-G、pLXT-R、pLXT-X。PCR產物測序結果經(jīng)比對，與質粒pKT0150上的ADH終止子序列和G418抗性基因的相似性分別為99%和100%?？寺〉男莨俳z酵母的xyl2基因經(jīng)比對，與畢赤樹干酵母xyl2基因相似性為83%。由于GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有休哈塔假絲酵母的xyl2基因序列，因此這是國內首次報道休哈塔假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因，基因序列如圖1。

2.2 高拷貝整合表達載體pLX-AGRX的構建

依次將ADH1終止子片段、G418抗性基因、特定2.2 kb rDNA片段和xyl2基因構建至質粒p406ADH1上，質粒構建過程如圖2。提取質粒pLX-AGRX采用酶切和PCR進行驗證，結果表明所有片段都正確連接至載體上，結果如圖3。

圖1 休哈塔假絲酵母木糖醇脫氫酶基因序列Fig.1 Gene sequence of Candida shehatae, xylitol dehydrogenase

圖2 構建表達載體pLX-AGRX示意圖Fig.2 Construction of expression vector of pLX-AGRX

圖3 Xho I和Xba I酶切鑒定結果Fig.3 Results of XhoⅠand XbaⅠdigestion reactionM1: DL15 000 Marker; 1: XhoⅠ、 XbaⅠ酶切陽性質粒pLX-AGRX-1結果; 2: XhoⅠ酶切陽性質粒pLX-AGRX-1結果; 3: XhoⅠ、 XbaⅠ酶切陰性質粒pLX-AGRX-2結果; 4: XhoI酶切陰性質粒pLX-AGRX-2結果; M2: DL2 000 MarkerM1: DNA Marker DL15 000; 1: The positive plasmid pLX-AGRX-1 digested with XhoⅠand XbaⅠ; 2: The positive plasmid pLX-AGRX-1 digested with XhoⅠ; 3: The positive plasmid pLX-AGRX-2 digested with XhoⅠand XbaⅠ; 4: The positive plasmid pLX-AGRX-2 digested with XhoⅠ; M2: DNA Marker DL2 000

由圖3可以看出酶切驗證結果pLX-AGRX-1和pLX-AGRX-2，2個質粒均呈陽性結果，圖中呈現(xiàn)清晰的2條目的條帶，1條在7 925 bp左右，另1條在1 095 bp左右，成功構建表達載體pLX-AGRX。

2.3 重組釀酒酵母的篩選與鑒定

選取最高G418濃度(800 μg/mL)YPD平板上長勢較好的6個單菌落，作為重組菌株，分別命名為LX-1、LX-2、LX-3、LX-4、LX-5、LX-6。對篩選得到的6個高拷貝轉化子提取基因組DNA，通過PCR擴增木糖醇脫氫酶基因，由圖4可以確定質粒載體已整合到釀酒酵母的染色體上，以初始菌株釀酒酵母W5作為陰性對照，結果顯示W(wǎng)5無此條帶，證明構建的重組質粒載體pLX-AGRX已整合于釀酒酵母W5的染色體基因組中。

圖4 陽性轉化子的PCR鑒定結果Fig.4 PCR identification of positive transformantM: DNA Marker DL2 000; 1、 2、4～7: 轉化子PCR結果; 3: W5基因組PCR結果M: DNA Marker DL2 000; 1, 2, 4～7: PCR result of the transformants; 3: PCR result of W5 genome

2.4 重組釀酒酵母的木糖醇脫氫酶酶活

測得受體菌釀酒酵母W5、供體菌休哈塔絲酵母20335及選取的6個轉化子的木糖醇脫氫酶酶活結果見表3。

從酶活的測定結果可以看出，選取的6個轉化子XDH活力均高于受體菌W5，但活力不如供體菌20335。6個耐G418抗性的重組菌株LX-1、LX-2、LX-3、LX-4、LX-5和LX-6，其酶活分別為48.194 9、49.184 1、47.032 2、65.957 4、34.606 1、60.463 3 μ/mg。LX-4、LX-6重組菌XDH活力與W5相比有較大幅度提高，分別為W5的2.16和1.98倍；LX-1、LX-2、LX-3重組菌XDH活力居中，分別為W5的1.58、1.61、1.54倍；LX-5重組菌XDH活力較小，為W5的1.13倍。結果表明所構建的質粒載體pLX-AGRX轉化釀酒酵母細胞W5后成功地實現(xiàn)了木糖醇脫氫酶的高效表達。

表3 不同菌株中木糖醇脫氫酶的比活力(U/mg)

2.5 重組菌的穩(wěn)定性

重組菌LX-4連續(xù)傳代60世代后的穩(wěn)定性為99.69%，表明所構建的高拷貝整合表達載體已穩(wěn)定地整合到了工業(yè)釀酒酵母W5的染色體上，成為其基因組的一部分，使目的基因具有良好的遺傳穩(wěn)定性。重組菌株適合非選擇性壓力條件下的工業(yè)生產粗放環(huán)境。

3 討 論

木糖醇脫氫酶是木糖代謝的重要限速酶之一，它的活性高低直接關系到乙醇產量的多少。本研究根據(jù)已有木糖醇脫氫酶蛋白相似性較高的特點設計簡并引物，首次擴增得到休哈塔假絲酵母的木糖醇脫氫酶基因并構建高效表達木糖醇脫氫酶基因的高效表達載體pLX-AGRX。所構建的質粒必須有以下特點：一是載體上要有完整的表達盒，本研究用ADH1終止子替換CYC1終止子，然后插入木糖醇脫氫酶基因，與質粒本身自帶的ADH1啟動子構成完整的表達盒；二是載體上要有用于篩選陽性重組子的選擇標記，本研究中構建質粒所使用的選擇標記是目前文獻報道中廣泛使用的G418抗性基因，該基因克隆于Addgene公司的商品化質粒pKT0150；三是載體上要有與釀酒酵母同源的整合位點，酵母基因組中rDNA有100～200個重復單元，本研究以此為整合位點以提高木糖醇脫氫酶的表達量。

本研究得到的木糖醇脫氫酶酶活較高，最高的重組菌LX-4酶活可達65.957 4 U/mg，為W5的2.16倍。分析主要原因可能是本研究選用的提取酵母總蛋白的方法與以前報道的不同，本研究在測定木糖醇脫氫酶酶活之前提取粗酶液時，選擇了Novagen公司的YeastBusterTM酵母專用蛋白抽提試劑盒對酵母菌株的活性蛋白進行提取。用該試劑盒中提供的試劑對酵母細胞進行處理后，顯微鏡鏡檢處理后的菌體細胞，基本看不到完整的細胞，細胞破碎率在95%以上，得到的粗提物中蛋白量大，活性蛋白比例較高，木糖醇脫氫酶的活力得以充分發(fā)揮。

[1] 辛亮, 秦銳, 宋剛, 等. 丙酮酸脫羧酶基因和乙醇脫氫酶基因表達載體的構建[J]. 微生物學雜志, 2012, 32(2): 9-14.

[2] 楊柳, 葉菁, 陳小燕, 等. 木糖異構酶基因xylA 表達載體構建[J]. 微生物學雜志, 2014, 34(3): 9-13.

[3] 鐘桂芳, 付秀輝, 孫君社, 等. 發(fā)酵木糖生產酒精的研究進展及其應用前景[J]. 微生物學雜志, 2004, 24(1): 42-45.

[4] Sun Y, Cheng JY. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review[J]. Bioresource Technology, 2002,83(1): 1-11.

[5] Ladisch MR, Lin KW, Voloch M, et al. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass[J]. Enzyme and Microbial Technology, 1983, 5(2):82-102.

[6] 張潔寧, 田沈, 楊秀山. 提高木糖代謝能力的釀酒酵母Y5-X3的初步構建[J]. 可再生能源, 2012, 30(4): 47-51.

[7] 湯斌, 張風琴, 湯文晶, 等. 釀酒酵母代謝木糖工程菌的構建[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(11): 16-20.

[8] 張穎, 馬瑞強, 洪浩舟, 等. 微生物木糖發(fā)酵產乙醇的代謝工程[J]. 生物工程學報, 2010 , 26(10): 1436-1443.

[10]Chu BCH, Lee H. Genetic improvement ofSaccharomycescerevisiaefor xylose fermentation[J]. Biotechnology Advances, 2007, 25: 425-441.

[11]沈煜, 王穎, 鮑曉明, 等. 釀酒酵母木糖發(fā)酵酒精途徑工程的研究進展[J]. 生物工程學報, 2003, 19(5): 636-640.

[12]蔣凱, 李崎, 顧國賢. 構建高產谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究[J]. 生物工程學報, 2007, 23(6): 1071-1076.

[13]Yuan Ping, Hong-Zhi Ling, Jing-Ping Ge, et al. Xylitol production from non-detoxified corncob hemicellulose acidhydrolysate byCandidatropicalis[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 75: 86-91.

[14]張玉寶. 轉化木糖醇生產L-木酮糖菌株的篩選[D]. 泰安: 山東農業(yè)大學，2013.

Construction of High-Copying Vector of Xylitol Dehydrogenase Gene and Its Expression in Saccharomyces cerevisiae

GE Jing-ping1, PEI Fang-yi1, HUANG Shou-feng1, ZHAO Jing-wen1, SONG Gang1, SUN Hong-bing1, LUO Xue1, PING Wen-xiang1, 2

(1.Coll.ofLifeSci.,HeilongjiangUni.,Agric.Microorg.Tech.Edu.Engin.Res.Ctr.,HeilongjiangProv.,Harbin150080; 2.Microb.Tech.Res.Ctr.forAgric.Edu.Pro.,HeilongjiangProv.,Harbin150500)

Being in a node position in xylose metabolism, xylitol dehydrogenase (XDH) is able to oxidate xylitol into xylulose. In this experiment the XDH genexyl2, ADH1 terminal subsequence and resistant gene G418 (KanR) of palsmid pKT0150 from the genome ofCandidashehatae20335 using PCR cloning, as well as specific 2.2 kb rDNA fragment ofS.serevisiaeW5 were obtained. The multicopying integrated expression vector pLX-AGRX was constructed using integrated vector p406ADH1 ofS.serevisiaeas a framework by means of genetic engineering. The recombinant vector pLX-AGRX was linearized and transferred intoS.cerevisiaeW5, then screened through high concentration G418 and PCR for double characterization, and proved that the recombinant vector pLX-AGRX was integrated into genome ofS.serevisiaeW5, it was tested that the activity of XDH was as high as 65.957 4 U/mg.

Candidashehatae; xylitol; xylitol dehydrogenase; vector construction;S.cerevisiae

國家自然科學基金項目(31270143)；國家自然科學基金項目(31270534)；國家自然科學基金項目(31470537)；

葛菁萍 女，博士，教授，碩士生導師。主要研究方向為微生物學。E-mail：gejingping@126.com。

* 通訊作者。男，博士，教授，碩士生導師。主要研究方向為微生物遺傳育種。Tel：0451-86609016，E-mail：wenxiangping@aliyun.com

2015-03-09；

2015-04-20

Q933

A

1005-7021(2015)05-0008-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.002

黑龍江省高等學?？萍紕?chuàng)新團隊(農業(yè)微生物發(fā)酵技術)項目(2012td009)