葉菡洋，金建，李占園，陳琰，鄭育，金領(lǐng)微，周志宏

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.腎內(nèi)科；2.內(nèi)分泌科）

·論 著·

microRNA-101a與COX-2在尿酸性腎病模型中的變化

葉菡洋1，金建2，李占園1，陳琰1，鄭育1，金領(lǐng)微1，周志宏1

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.腎內(nèi)科；2.內(nèi)分泌科）

目的：觀察microRNA-101a（miR-101a）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）在尿酸性腎病大鼠模型中的變化情況。方法：將24只雄性SD大鼠隨機分成3組，即正常對照組（BC組）、模型組（M組）和塞來昔布組（S組），每組各8只，以含酵母和腺嘌呤的飼料喂養(yǎng)造模，21 d后檢測各組大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）的含量，并用實時定量PCR技術(shù)檢測大鼠腎臟皮質(zhì)中miR-101a的表達(dá)及Wersten Blot法檢測COX-2及caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：M組Cr、BUN、UA較BC組升高（P＜0.05），S組Cr、BUN、UA較M組降低（P＜0.05）；M組miR-101a的表達(dá)較BC組明顯降低（P＜0.05），S組miR-101a的表達(dá)較M組大鼠升高（P＜0.05）；M組COX-2及caspase-3的表達(dá)較BC組明顯升高（P＜0.05），S組COX-2及caspase-3的表達(dá)較M組明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：miR-101a表達(dá)降低及COX-2表達(dá)升高可能參與高尿酸引起的腎臟損害的過程，COX-2特異性抑制劑塞來昔布可減輕其損害。

尿酸性腎??；microRNA-101a；環(huán)氧化酶-2；塞來昔布；凋亡；大鼠

高尿酸血癥在我國當(dāng)代人口中越來越常見，并有年輕化趨勢，其導(dǎo)致的尿酸性腎病也是引起腎臟功能不全常見的原因之一。尿酸性腎病的主要機制是尿酸鹽結(jié)晶在腎小管和腎間質(zhì)的沉積而引起的局部炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡壞死，上皮萎縮，間質(zhì)纖維化。環(huán)氧化酶-2（cycloxygenase-2，COX-2）是公認(rèn)的介導(dǎo)炎癥的重要蛋白之一，在多種炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的促進(jìn)作用[1]。近年來，研究報道m(xù)icroRNA-101a （miR-101a）具有調(diào)節(jié)COX-2表達(dá)的作用，參與許多炎癥反應(yīng)的過程[2-3]。本實驗建立高尿酸血癥大鼠模型，觀察miR-101a和COX-2的表達(dá)水平，并研究COX-2特異性抑制劑塞來昔布是否具有減輕高尿酸引起的腎臟損害的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 24只雄性SD大鼠（體質(zhì)量200～250 g，實驗動物合格證號20120002）購自上海萊克實驗動物有限責(zé)任公司；酵母干粉，UNIPATH公司產(chǎn)品；腺嘌呤，MERCK公司產(chǎn)品；塞來昔布由輝瑞制藥有限公司提供；血生化分析儀Roche cobasc 501購自德國羅氏診斷有限公司；RT試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司；miScript Reverse Transcription Kit購自Qiagen公司；DEPC水（RNase-free and DNasefree）均購自Invitrogen公司；PCR試劑盒（SYBR Green Real time PCR Master Mix），96孔板及封板膜均購自ABI公司；電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自BIO-RAD公司；COX-2和caspase-3引物均購自Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；COX-2抗體、caspase-3抗體及山羊抗兔抗體購自Abcam公司；Backman DU800計算機分光光度分析儀Backman；酶標(biāo)儀ECX800購自Bio-TEX；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 大鼠飼養(yǎng)、分組及模型制作 24只雄性SD大鼠，均清潔級飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定飼養(yǎng)，分3組，各8只：①正常對照組（BC組）：給予常規(guī)的飼料（市售飼料）飼養(yǎng)；②模型組（M組）：給予含酵母粉和腺嘌呤飼料（85 g市售飼料+15 g酵母+100 mg腺嘌呤）飼養(yǎng)[4]；③塞來昔布組（S組）：給予含酵母粉和腺嘌呤飼料（85 g市售飼料+15 g酵母+100 mg腺嘌呤）飼養(yǎng)，并予塞來昔布懸液25 mg/kg每日灌胃。21 d后靜脈取血并取左側(cè)腎臟皮質(zhì)組織檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.3 血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）的檢測 造模21 d后，抽取大鼠靜脈血，用常規(guī)生化測定方法檢測腎功能指標(biāo)Cr、BUN、UA的水平。

1.4 Real time PCR技術(shù)檢測各組中miR-101a的表達(dá)量 取腎臟皮質(zhì)組織50～100 mg，加Trizol裂解，氯仿萃取，異丙醇濃縮過夜，提取總RNA，再取100 ng總RNA，應(yīng)用miRNA Isolation Kit分離小于100 nt的小分子RNA，應(yīng)用miScript Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物：5’-GTC GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTT CGTT-3’。在ABI 7500 FAST進(jìn)行定量PCR檢測。PCR條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。上游引物：5’-TTCGTCGTCGTCGGTACAGTACTGTGAT-3’，下游引物：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。以U6 RNA為內(nèi)參，目的基因的相對表達(dá)率（relativeexpression，RQ）采用△△CT方法計算，miR-101a的△CT sample= CT sample-CT/U6 sample，△CT control=CT control-CT U6 control，△△CT=△CT sample-△CT control。

1.5 Western Blot檢測各組中COX-2及caspase-3蛋白表達(dá)水平 取腎臟皮質(zhì)組織約30 mg，加蛋白裂解液研磨，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白50 μ g，行10% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h。一抗（COX-2 antibody 1∶800，caspase-3 antibody 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次。室溫下加入IgG抗體（1∶4 000）孵育1.5 h，洗膜3次，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)選擇800通道進(jìn)行掃描條帶，以βactin作為內(nèi)參照標(biāo)化COX-2及caspase-3的表達(dá)，各組生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，獨立的兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清Cr、BUN、UA的比較 SD大鼠飼養(yǎng)21 d后M組大鼠血Cr、BUN、UA均高于BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明尿酸性腎病大鼠模型造模成功。S組大鼠血Cr、BUN、UA低于M組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腎功能指標(biāo)的比較（n=8，±s）

與BC組比：aP＜0.05；與M組比：bP＜0.05

2.2 Real time PCR技術(shù)檢測各組中miR-101a的表達(dá)量 miR-101a的表達(dá)水平在M組（為0.48±0.17）較BC組（為1.00±0.00）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而S組（0.71±0.21）較M組（0.48±0.17）明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 Western Blot法檢測各組中COX-2及caspase-3蛋白表達(dá)水平 COX-2和caspase-3的表達(dá)水平在M組較BC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而S組較M組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

圖1 Real time PCR技術(shù)檢測miR-101a的表達(dá)

圖2 Western Blot法檢測各組中COX-2及caspase-3蛋白表達(dá)水平

尿酸性腎病對腎臟的損害以腎小管-間質(zhì)病理改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，光鏡下可見腎小管呈囊性擴張，上皮萎縮，間質(zhì)細(xì)胞萎縮，間質(zhì)纖維化，伴大量淋巴和單核細(xì)胞的浸潤[4]。研究報道，用含0.25%的腺嘌呤飼料飼養(yǎng)的雄性Wistar大鼠出現(xiàn)血尿酸升高，腎功能下降，腎臟組織炎癥遞質(zhì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B（NF-κB）等表達(dá)增多，伴有腎小管凋亡增多，腎間質(zhì)膠原纖維含量增多[5]。Lobo等[6]研究50例血透患者發(fā)現(xiàn)伴有高尿酸血癥的患者血清中TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等炎癥因子處于高水平，推測尿酸在炎癥的發(fā)生過程中起重要作用?？梢娔蛩嵝阅I病腎臟組織存在炎癥反應(yīng)，這也是導(dǎo)致慢性腎臟損害的機制之一。本實驗用酵母粉聯(lián)合腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠尿酸性腎病模型，21 d后測腎功能指標(biāo)明顯升高，可見模型誘導(dǎo)成功。

COX-2是環(huán)氧化酶家族成員之一，介導(dǎo)前列腺素類炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，在炎癥過程中起重要的作用。在正常生理條件下，細(xì)胞COX-2處于低表達(dá)水平[7]，當(dāng)受到炎癥刺激時，COX-2被誘導(dǎo)處于高表達(dá)水平。在缺血再灌注腎臟損傷中，COX-2大量被誘導(dǎo)生產(chǎn)，促進(jìn)局部炎癥反應(yīng)，而神經(jīng)生長因子-1能通過抑制COX-2的表達(dá)，減少炎癥因子的產(chǎn)生，減少細(xì)胞凋亡[8]。有學(xué)者通過體外培養(yǎng)腎臟系膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)一定高濃度的尿酸能直接誘導(dǎo)COX-2和PGE2（前列腺素E2）的合成，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[9]。caspase-3是細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白，反映細(xì)胞的整體凋亡水平。本實驗在高尿酸腎病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)COX-2和caspase-3表達(dá)水平明顯升高，推測COX-2在高尿酸引起的腎臟炎癥反應(yīng)中起重要作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。用COX-2特異性抑制劑治療后，COX-2和caspase-3表達(dá)減少，細(xì)胞凋亡水平降低，進(jìn)一步說明COX-2在高尿酸引起的炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用。此外，本實驗中S組caspase-3表達(dá)水平較BC組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明S組細(xì)胞凋亡水平較BC組高?，F(xiàn)研究已證實COX-2存在結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型兩種形式，COX-2抑制劑能阻斷誘導(dǎo)型COX-2，減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)腎臟組織，也能阻斷結(jié)構(gòu)型COX-2對腎臟產(chǎn)生毒害作用[10]。

本研究還發(fā)現(xiàn)在高尿酸腎病大鼠模型中miR-101a表達(dá)降低，并且與COX-2的表達(dá)水平呈相反趨勢。有研究[11]報道，miR-101a與COX-2基因的3’UTR區(qū)序列互補配對并與之結(jié)合從而抑制該基因的表達(dá)。此外，在一些腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)miR-101a表達(dá)降低而COX-2升高，推測miR-101a對COX-2具有調(diào)節(jié)作用，這可能參與了腫瘤發(fā)生的機制[3，12]。Tanaka等[13]通過實驗證實帶有熒光標(biāo)記的COX-2 3’URT區(qū)域的報告結(jié)構(gòu)基團，起熒光活性能被miR-101a顯著抑制，說明miR-101a能直接與COX-2的3’URT直接結(jié)合，強烈推測COX-2是miR-101a的靶基因之一。成熟的miR-101a能直接調(diào)控COX-2的表達(dá)，在本實驗中，我們推測miR-101a在高尿酸性腎病中表達(dá)異常降低可能與COX-2表達(dá)增多有關(guān)。

綜上所述，我們推測miR-101a/COX-2在高尿酸引起的腎臟損害中起重要作用，具體機制尚有待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：胡苗苗）

The role of microRNA-101a and cycloxygenase-2 in kidney damage induced by hyperuricemia

YEHanyang1,JIN Jian2,LI Zhanyuan1,CHEN Yan1,ZHENG Yu1,JIN Lingwei1,ZHOU Zhihong1.
1.Department of Nephrology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027;2.Department of Endocrinology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To investigate the effects of miR-101a and cycloxygenase-2 (COX-2) on rats model of urate nephropathy.Methods:Twenty four rats models of urate nephropathy through fed with yeast and adenine for 21 days were divided into three groups,normal control groups,model groups and celecoxib groups.Seum creatinine (Cr),blood urea nitrogen (BUN) and blood uric acid (UA) was tested after feeding with yeast and adenine for 21 days.The real time PCR was preformed to analyze the expression of miR-101a and Western Blot was preformed to analyze the expression of COX-2 and caspase-3 in renal cortex.Results:Cr,BUN and UA of model group were significantly higher than that of normal control groups (P＜0.05).The expression of miR-101a n renal cortex from model groups was lower than that of normal control groups (P＜0.05),while higher than that of celecoxib groups (P＜0.05).The expression of COX2 and caspase-3 in renal cortex from model groups were higher than that of normal control group (P＜0.05),while lower than that of celecoxib groups (P＜0.05).Concluion:Decreasing miR-101a and increasing COX2 may involve in kidney damage induced by hyperuricemia,celecoxib as a specific inhibitor protects kidney from this damage.

urate nephropathy; microRNA-101a; cycloxygenase-2; celecoxib; apoptosis; rats

R541

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.006

2014-06-06

葉菡洋（1979-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

周志宏，主任醫(yī)師，Email：markzhou@wzhealth.com。