諸夢露，劉婷婷，彭曉丹，林紹強（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

·論 著·

ST6Gal I調(diào)控胃癌細胞SGC7901增殖遷移能力的初步研究

諸夢露，劉婷婷，彭曉丹，林紹強
（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

目的：探討唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST6Gal I）對人胃癌細胞（SGC7901）增殖和遷移能力的影響。方法：采用脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000），構(gòu)建ST6Gal I高表達和ST6Gal I低表達細胞株，以空載體（Vector）作為對照組。采用實時熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染后SGC7901細胞中ST6Gal I的mRNA水平；用細胞CCK-8試劑盒及Transwell小室實驗檢測轉(zhuǎn)染前后細胞的增殖、遷移情況。結(jié)果：成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞株分別為Vector、X61-4和PS7；與Vector組相比，PS7組的mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05），X61-4組則顯著降低（P＜0.05）；X61-4的細胞增殖明顯高于PS7細胞（P＜0.05）；胃癌細胞ST6Gal I的表達水平與細胞遷移能力成正相關(guān)，PS7組的遷移率顯著高于X61-4組（P＜0.01）和Vector組（P＜0.01），X61-4組的遷移率低于Vector組（P＜0.05）。結(jié)論：細胞實驗表明，降低ST6Gal I的表達可以有效促進胃癌SGC7901細胞的增殖能力，而上調(diào)ST6Gal I可以增強胃癌細胞的遷移能力。因此，ST6Gal I是與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，是潛在的腫瘤分子治療靶點。

唾液酸轉(zhuǎn)移酶；胃腫瘤；唾液酸化；增殖；遷移

胃癌是世界上病死率極高的一種惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，每年因癌癥死亡人達100萬，其中胃癌致死率位列第二[1]。復發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者死亡的主要因素，但具體機制尚未清楚[2]。糖復合物由一些重要的生物分子構(gòu)成，包括糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖[3]，腫瘤相關(guān)的糖復合物已經(jīng)成為重要疾病發(fā)生發(fā)展的生物標記之一[3-5]。糖蛋白和糖脂寡糖鏈的末端往往裝飾著唾液酸，唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST6Gal I）是糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，負責在糖蛋白或糖脂的非還原性末端特異性地加上單個唾液酸或多個唾液酸[6]。糖基化修飾的一種重要形式是唾液酸化修飾，ST6Gal I通過α2，3-，α2，6-或α2，8-連接方式將唾液酸鏈接到特定的底物上，屬于糖基化轉(zhuǎn)移酶家族。在此，我們重點研究α2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，ST6Gal I在轉(zhuǎn)移腫瘤組織中呈高表達[7]。

最新研究報道，腫瘤細胞的黏附和侵襲受到細胞表面過度α-2，6唾液酸化的極大影響。本課題擬以人胃癌細胞株（SGC7901）為研究對象，通過沉默和上調(diào)細胞表面的ST6Gal I的表達，經(jīng)氨基糖苷類抗生素（G418）和殺稻瘟菌素S鹽酸鹽篩選后獲得穩(wěn)定細胞株，進而探討細胞的增殖和遷移能力的研究，為胃癌的基因治療提供有效靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞 SGC7901細胞由溫州醫(yī)科大學實驗室提供，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2 材料和儀器 FBS胎牛血清、1640培養(yǎng)基、Transwell（美國Gibco公司）；實時熒光定量PCR real-time PCR，RT-PCR）試劑盒（日本TaKaRa公司）；引物（溫州長風生物有限公司）；Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；PCR儀（德國Biometra公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Spectra Max M2多功能酶標儀（美國Molecular Devices公司）。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建：干擾質(zhì)粒Vector和ST6Gal I低表達質(zhì)粒（X61-ST6Gal I）均由美國Invitrogen公司合成并構(gòu)建。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：SGC7901細胞培養(yǎng)于含有10% FBS、1%雙鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長到70%～80%時用含有0.25% EDTA的胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞用脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細胞分為3組，分別為ST6Gal I高表達細胞株P(guān)S，ST6Gal I低表達細胞株X61，陰性對照組細胞株Vector。經(jīng)過30 d的篩選，用RT-PCR進行驗證，選擇轉(zhuǎn)染效果最好的單克隆株進行后續(xù)實驗。

1.3.3 RT-PCR檢測各組細胞株：ST6Gal I的表達量：①提取ST6Gal I RNA：設(shè)計2對RT-PCR的引物，用于擴增ST6Gal I和GAPDH序列。引物由美國Invitrogen公司合成。引物序列如下表1。細胞總RNA的具體提取步驟可參照文獻[2]。各樣品取500 ng的總RNA按照Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（primerscript?RTMaster Mix）的說明書進行操作，用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱進行保存。②擴增ST6Gal I基因：將反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA稀釋10倍后，各取1μL 的cDNA稀釋液根據(jù)RT-PCR試劑盒進行PCR擴增（此操作在冰上進行），實驗重復3次。擴增體系如下表2，PCR循環(huán)參數(shù)如下表3。③在每組樣品中挑選最佳效果的樣品，取5μL于1.0%的瓊脂糖膠上進行電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。

表1 RT-PCR各基因的引物

表2 RT-PCR擴增體系

表3 RT-PCR循環(huán)參數(shù)

1.3.4 細胞增殖活性實驗：分別取對數(shù)生長期的3組細胞，在96孔板中接種細胞懸液，取其中一塊板作為0 h時間點，其余的繼續(xù)在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。測定時間點設(shè)置為0、24、48、72、96、120、144 h。時間到點時，加入10 μL的CCK-8溶液，用酶標儀（酶聯(lián)免疫檢測儀）測定450 nm處的吸光度。

1.3.5 Transwell小室細胞遷移實驗：選擇單層生長狀態(tài)良好的3組細胞，細胞無血清饑餓24 h。在Transwell小室的下室加入600μL含10% FBS的1640培養(yǎng)基，上室加入培養(yǎng)基100μL，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，室溫下固定，結(jié)晶紫染色。采用Leica DC 300F正置顯微鏡進行觀察和拍照。最后，用33%醋酸脫色，在酶標儀上570 nm處檢測其OD值，以O(shè)D相對值表示細胞遷移能力的大小。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有實驗均重復3次，所有數(shù)據(jù)用±s表示，多組間均數(shù)比較采用ANOVA檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ST6Gal I mRNA表達水平 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染共篩選出9個PS、12個X61和7個Vector單克隆細胞株。PS組細胞mRNA表達均高于SGC7901細胞（見圖1A），X61組細胞的表達均低于SGC7901細胞（見圖1B），其中以PS7細胞株和X61-4號細胞株效果最佳，Vector組與SGC7901細胞相比，差異無統(tǒng)計學意義（見圖1C）。因此，選用PS7、X61-4、Vector-2作為實驗對象，分明命名為PS7、X61-4和Vector。

瓊脂糖凝膠電泳圖中ST6Gal I與GAPDH灰度值的比值結(jié)果顯示（見圖2），PS7組、X61-4組和Vector 組mRNA表達水平分別為：1.096±0.09、0.43±0.03、0.69±0.07。統(tǒng)計學分析表明，PS7組與Vector組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），X61-4組與Vector組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RT-PCR實驗結(jié)果表明，成功構(gòu)建ST6Gal I穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達細胞株P(guān)S7和ST6Gal I穩(wěn)轉(zhuǎn)低表達細胞株X61-4。

圖1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株ST6Gal I的mRNA表達水平

圖2 RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

2.2 ST6Gal I的改變對SGC7901細胞增殖和遷移能力的影響

2.2.1 ST6Gal I對SGC7901細胞體外增殖的影響：為了考察ST6Gal I在體外對SGC7901細胞增殖能力的影響，我們在建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的基礎(chǔ)上，用CCK-8試劑盒檢測各組細胞體外增殖情況。各組細胞培過7 d，并定時測定OD值，OD值越大說明活細胞越多，細胞增殖能力則越強。從曲線趨勢（見圖3）我們可以看出Vector組細胞增殖速度最快，PS7組細胞增殖速度較慢，X61-4組細胞增殖速度居中，與Vector組細胞相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖3 各組細胞生長曲線

2.2.2 Transwell小室細胞遷移實驗檢測各組細胞的遷移能力：為了驗證ST6Gal I的表達量對細胞遷移能力的影響，我們用Transwell小室細胞遷移實驗檢測各組細胞的遷移能力。用Leica DC 300F正置顯微鏡進行拍照（見圖4），PS7組細胞的穿膜細胞數(shù)最多，X61-4組細胞最少，Vector組細胞居中。拍照后，用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液在酶標儀上570 nm處測其OD值。OD值分別為：X61-4組細胞：0.45±0.14，Vector組細胞：1.29±0.18，PS7組細胞：2.35±0.30。以穿膜細胞的相對OD值來反映細胞遷移力的大小。PS7組細胞的遷移能力明顯升高（見圖5），與Vector組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），X61-4組細胞明顯降低，與Vector組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明上調(diào)ST6Gal I表達可以促進細胞的遷移能力。

圖4 Transwell小室細胞遷移實驗檢測各組細胞的遷移能力（×200）

圖5 各組細胞的遷移能力統(tǒng)計

3 討論

唾液酸是連接在細胞表面糖蛋白或糖脂糖鏈末端的一種生理pH值條件呈負電荷的，含有9個碳原子的糖[8]。研究表明，唾液酸酶和唾液酸糖基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)參與許多重要的生理和病理過程[9-11]。在腫瘤細胞中，腫瘤的惡性程度、不良預后常常與唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異常表達有關(guān)。一般而言，唾液酸轉(zhuǎn)移酶的異常變化，伴隨著腫瘤的惡化、高侵襲性和預后差。其中，ST6Gal I與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，廣泛參與腫瘤細胞的異常增殖信號的轉(zhuǎn)導、細胞黏附、細胞遷移、對輻射的耐受性和對化療藥的耐藥性等[12-13]。

為了探索ST6Gal I對胃癌細胞的影響，本研究通過脂質(zhì)體2000將ST6Gal I高低表達質(zhì)粒及相應空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SGC7901細胞。轉(zhuǎn)染后用抗生素進行穩(wěn)定篩選，采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞ST6Gal I mRNA的表達水平，結(jié)果顯示PS7組細胞的ST6Gal I表達量最高，X61-4組細胞最低。以上結(jié)果提示我們成功得到了ST6Gal I高低表達陽性克隆細胞株。有實驗顯示，苑天紅等[14]采用ASO（反義核酸）與siRNA兩種技術(shù)，有效地降低人結(jié)腸癌細胞（SW480）的ST6Gal I的表達并降低細胞表面唾液酸化水平，還能顯著降低SW480細胞黏附和侵襲細胞外基質(zhì)（ECM）的能力。最近幾年，有報道顯示為了了解ST6Gal I與惡性結(jié)腸癌的相關(guān)性，Park等[15]在SW480細胞中構(gòu)建了ST6Gal I敲除細胞株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管是體外實驗還是體內(nèi)實驗，ST6Gal I表達量的降低將顯著促進細胞增殖和腫瘤生長。本研究為了探索ST6Gal I對胃癌增殖遷移作用的影響，在之前構(gòu)建的3組細胞的基礎(chǔ)上，采用CCK-8試劑盒檢測轉(zhuǎn)染ST6Gal I后的細胞在24、48、72、96、120、144 h的細胞增殖能力，結(jié)果顯示ST6Gal I表達水平的降低顯著促進SGC7901細胞的增殖，但ST6Gal I表達水平的升高沒有抑制SGC7901細胞的增殖。這種現(xiàn)象不只在細胞實驗中出現(xiàn)，在SW480細胞[15]腫瘤移植實驗的結(jié)果同樣顯示ST6Gal I敲除細胞株成瘤性顯著增加，而ST6Gal I高表達細胞株的成瘤性與陰性對照組相比，雖然有所增加，差異無統(tǒng)計學意義。綜上所述，ST6Gal I與SGC7901細胞的增殖有關(guān)，但是其內(nèi)在分子機制仍需進一步的研究。為了探索ST6Gal I對胃癌遷移作用的影響，我們進行了Transwell體外遷移實驗。結(jié)果顯示，ST6Gal I高表達細胞株的遷移能力顯著增強，而Vector組細胞株的遷移能力次之，ST6Gal I低表達細胞株的遷移能力最弱。從結(jié)果中我們推斷ST6Gal I在胃癌遷移過程中發(fā)揮了重要作用，但ST6Gal I發(fā)揮了什么機制作用值得我們進行深入研究。

腫瘤惡性轉(zhuǎn)移對腫瘤患者的預后具有重要意義，尤其是惡性腫瘤患者發(fā)生死亡的一個最主要的原因就是腫瘤的轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的遷移和增殖與其細胞外基質(zhì)的相互作用是不可分割的，而腫瘤與細胞外基質(zhì)相互作用主要通過細胞表面糖復合物末端的的唾液酸化程度，腫瘤細胞表面唾液酸化的異?？梢灾苯佑绊懩[瘤細胞的遷移和增殖能力。

總之，ST6Gal I誘導的細胞膜表面受體的唾液酸化，從而影響腫瘤細胞功能變化，再結(jié)合唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑的研究，為開發(fā)新型有效的抗腫瘤藥物提供了可靠的依據(jù)。

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（本文編輯：吳昔昔）

Investigation of ST6Gal I on the ability of proliferation and migration in SGC7901 gastric cancer cell

ZHU Menglu,LIU Tingting,PENG Xiaodan,LIN Shaoqiang.
School of Pharmacy,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035

Objective:To explore the effect of α2,6 sialytransferase (ST6Gal I) on the abilities of proliferation and migration in SGC7901 cells.Methods:Gastric cancer cell lines SGC7901 were constructed to ST6Gal I high expression (PS7) and ST6Gal I lower expression (X61) with lipofectamine 2000 and empty vector (Vector) was used as a control group.The expression of ST6Gal I was examined with RTPCR.Cell proliferation was evaluated with the CCK-8 kit,and migration was evaluated with Transwell chamber assay.Results:The 3 stable transfected cell lines were constructed successfully.The most effective clone cells were chosed as our experimental cells,and named as Vector,X61-4 and PS7.In contrasted with Vector,the expression of ST6GAL I in X61-4 was statistically significant lower (P＜0.05),and PS7 was statistically significant higher (P＜0.05).Cell growth curve showed that cell proliferation of X61-4 was obviously higher than that of PS7 cells (P＜0.05).The transwell chamber assay results showed that the migration of PS7 was significantly higher than that of the X61-4 (P＜0.01) and Vector (P＜0.01),X61-4 was lower than that of the Vector (P＜0.05).Conclusion:Cell experiment results show that lower ST6Gal I can effectively promote the proliferation ability of SGC7901 gastric cancer cells,but high ST6Gal I can enhance gastric cancer cell migration ability.Therefore,ST6Gal I is related to the tumor proliferation and metastasis,and it is also a potential tumor molecular therapeutic targets.

ST6Gal I; stomach neoplasms; sialylation; proliferation; migration

R73-37

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.001

2014-10-29

國家自然科學基金資助項目（81071751，80212074）。

諸夢露（1988-），女，浙江寧波人，碩士生。

林紹強，教授，博士生導師，Email：shaotsiang@163.com。