匡重伸許航黃征朱桂云王勝

鈣蛋白酶抑制劑減少大鼠局灶性腦缺血再灌注模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡*

匡重伸①許航①黃征①朱桂云①王勝①

目的：研究鈣蛋白酶抑制劑calpeptin干預治療對大鼠局灶性腦缺血再灌注模型海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響及其可能機制。方法：選擇健康成年雄性SD大鼠128只作為研究動物，采用隨機數(shù)字表法將其分為MACO組、calpeptin組、DMSO組及sham組，制作大鼠左側大腦中動脈缺血再灌注模型，缺血2 h后分別再灌注6、12、24 h及48 h后進行神經(jīng)功能學評分，免疫組化檢測海馬CA1區(qū)神經(jīng)元caspase-3的表達，TUNEL法檢測原位細胞凋亡，觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡。結果：DMSO組的各項檢測指標與MACO組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；calpeptin組的神經(jīng)功能評分及caspase-3表達均低于同時間點MCAO組及DMSO組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；再灌注12、24、48 h后，calpeptin組神經(jīng)元凋亡情況優(yōu)于同時間點MCAO組及DMSO組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：calpeptin可減少大鼠局灶性腦缺血再灌注模型海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡，對腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與抑制caspase-3的表達有關。

鈣蛋白酶； 缺血再灌注損傷； 凋亡； caspase-3

隨著對缺血性腦損傷分子機制的深入了解，發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶家族成員鈣激活中性蛋白酶（calpain）在缺血性腦損傷中起重要作用，眾多研究表明，腦缺血后calpain大量被激活，激活后的calpain可通過多種途徑導致神經(jīng)元壞死，許多證據(jù)表明calpain也參與了缺血后神經(jīng)元的凋亡[1]。本實驗采用大鼠大腦中動脈栓塞實驗動物模型及側腦室注射技術，研究鈣蛋白酶抑制劑calpeptin對缺血再灌注后不同時相缺血側海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡、caspase-3表達及其對大鼠神經(jīng)功能的影響，現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠128只，體重250～280 g，由石河子大學實驗動物中心提供。采用隨機數(shù)字表法將其分為四組，即缺血再灌注對照組（MACO組）、calpeptin治療組（calpeptin組）、溶劑二甲基亞砜對照組（DMSO組）及假手術組（sham組），每組32只。每組又分為6、12、24和48 h四小組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 鈣蛋白酶抑制劑calpeptin購自calbiochem公司，二甲亞砜（DMSO）購自sigama公司。手術前大鼠用3.6%的水合氯醛（360 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥固定于腦立體定位儀上，暴露前囟，調節(jié)微調旋鈕，使微量注射器針尖正對左側側腦室（前囟左側1.8 mm，后0.8 mm），鉆孔，將微量注射器下移至軟腦膜，緩慢進針4.5 mm，calpeptin組制作MACO前左側側腦室注射calpeptin 50 μg（溶于二甲基亞砜5 μL中）；DMSO組MACO術前左側側腦室注射DMSO 5μL，注射時間5 min，留針5 min，注射后即進行造模手術。

1.2.2 MCAO模型的建立 參照Belayev等[2]改良的Longa方法，大鼠側腦室給藥后，在室溫（25 ℃）條件下，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切口，分離左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA）及翼腭動脈（不結扎該動脈），保護迷走神經(jīng)、膈神經(jīng)及氣管，結扎ECA近端，結扎CCA近心端，在CCA近動脈分叉處剪一小口后插入末端沾有石蠟的直徑為0.25 mm（4-0）尼龍線，插入深度距CCA分叉處（18.0±1.0）mm，此時有輕度的阻力感，扎緊CCA及其內的尼龍線，假手術組尼龍線插入的深度為10 mm，其余步驟相同，手術期間用100 W的白熾燈照射，保持大鼠肛溫在36.5～37.5 ℃。2 h后小心拉出尼龍線10 mm即造成再灌注模型，再次扎緊CCA及其內的尼龍線。

1.2.3 神經(jīng)功能評價 大鼠麻醉清醒后，參考Bederson等[3]5分制評分標準在相應的時間點對其進行神經(jīng)功能評定，0分：無神經(jīng)損傷體征；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：向對側轉圈；3分：向對側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。分值越高說明大鼠行為障礙越嚴重。

1.2.4 切片標本制備 實驗動物在設定時間點神經(jīng)功能評分后經(jīng)10%的水合氯醛腹腔麻醉后，依次用4 ℃生理鹽水200 mL及4 ℃ 4%多聚甲醛400 mL經(jīng)左心室升主動脈灌注，灌注完立即斷頭取腦，置4%多聚甲醛中后固定10 h，酒精梯度脫水，石蠟包埋，在海馬與齒狀回互抱處取材，每隔100 μm連續(xù)6 μm切片6張，切片貼附于預處理的載玻片上，用前脫蠟至水。相鄰切片分別行原位細胞凋亡、caspase-3檢測。

1.2.5 caspase-3活性蛋白檢測 切片脫蠟至水，滴加3%H2O2室溫20 min，蒸餾水洗3 min×3次，微波修復抗原；滴加牛血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗；滴加Ⅰ抗（兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體），37 ℃孵育120 min，PBS洗3 min×3次；滴加Ⅱ抗（生物素標記羊抗兔IgG），37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 min×3次；滴加試劑SABC，37 ℃孵育20 min，PBS洗5 min×4次；DAB顯色，PBS洗滌，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片、顯微鏡觀察。胞漿著色呈棕黃色為陽性細胞。

1.2.6 原位細胞凋亡檢測 用TdT介導的dUTP缺口末端標記技術[terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated dUTP nick end-labeling，TUNEL]檢測大鼠缺血側海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元凋亡，TUNEL試劑盒購自博士德公司。具體操作方法按說明書進行，即經(jīng)過氧化氫/甲醇、檸檬酸鈉處理后，滴加TUNEL反應混合液，37 ℃孵育60 min，隨后滴加過氧化物酶標記的抗熒光抗體，37 ℃孵育30 min。最后滴加DAB顯色底物，室溫、避光，顯微鏡下控制染色深淺。常規(guī)脫水、透明、封片。每一批實驗中設立陽性對照和陰性對照。陽性對照為在TUNEL標記反應前用DNaseⅠ（1 mg/mL）37 ℃溫箱孵育切片20 min，結果細胞核呈陽性。陰性對照為TUNEL標記反應液中省去TUNEL反應混合液，而只加標記液，結果細胞不顯色。在高倍鏡（×400）下觀察海馬CA1區(qū)中相互不重疊的4個視野，計數(shù)其中陽性細胞數(shù)，取均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠神經(jīng)功能學評分比較 sham組大鼠蘇醒后未見明顯的神經(jīng)功能學缺失；MCAO組再灌注24 h神經(jīng)功能缺失最嚴重。DMSO組神經(jīng)功能評分與MCAO組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；calpeptin組神經(jīng)功能評分低于MCAO組及DMSO組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2 各組海馬CA1區(qū)caspase-3表達情況比較 sham組的caspase-3表達很少；DMSO組caspase-3表達與同時間點MCAO組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；calpeptin組caspase-3表達低于同時間點MCAO組及DMSO組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況比較 sham組的神經(jīng)元凋亡很少，MCAO組在缺血2 h再灌注6 h有少量的神經(jīng)元凋亡，在24 h達高峰，DMSO組神經(jīng)元凋亡情況與同時間點MCAO組比較，差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；再灌注12、24、48 h后，calpeptin組神經(jīng)元凋亡情況優(yōu)于同時間點MCAO組及DMSO組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分情況比較（±s） 分

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能評分情況比較（±s） 分

*P＜0.05，**P＜0.01，與MCAO組同時間點比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與DMSO組同時間點比較

組別 6 h 12 h 24 h 48 h MCAO組（n=32） 2.50±0.53 2.63±0.52 2.75±0.46 2.38±0.52 DMSO組（n=32） 2.63±0.52 2.50±0.76 2.63±0.74 2.38±0.74 calpeptin組（n=32） 1.75±0.71*△ 1.75±0.46*△ 1.50±0.53**△△ 1.63±0.74*△

表2 各組不同時間點caspase-3表達情況比較（±s）

表2 各組不同時間點caspase-3表達情況比較（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，與MCAO組同時間點比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與DMSO組同時間點比較

組別 6 h 12 h 24 h 48 h sham組（n=32） 1.75±0.41 1.68±0.35 1.82±0.45 1.71±0.38 MCAO組（n=32） 13.75±4.23 30.13±6.33 50.13±12.92 36.13±10.67 DMSO組（n=32） 14.50±4.38 29.63±5.51 52.63±13.18 37.5±12.44 calpeptin組（n=32） 9.25±3.73*△ 22.63±7.48* 35.75±11.93**△△ 24.38±10.46*△

表3 各組不同時間點神經(jīng)元凋亡情況比較（±s）

表3 各組不同時間點神經(jīng)元凋亡情況比較（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，與MCAO組同時間點比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與DMSO組同時間點比較

組別 6 h 12 h 24 h 48 h sham組（n=32） 1.55±0.38 1.48±0.32 1.61±0.41 1.57±0.35 MCAO組（n=32） 4.63±1.58 26.50±7.19 44.75±13.44 33.50±9.65 DMSO組（n=32） 4.15±1.78 27.75±6.23 45.63±13.15 31.25±8.07 calpeptin組（n=32） 2.75±1.82 16.75±5.63**△△ 30.75±11.79*△ 21.25±5.97**△

3 討論

大量研究表明，腦缺血可引起如下神經(jīng)損傷級聯(lián)反應：興奮性氨基酸自突觸前膜大量釋放；谷氨酸受體過度激活引起大量Ca2+釋放入胞漿；導致細胞內Ca2+超載；細胞內Ca2+超載使依賴于Ca2+的胞內蛋白類（包括鈣調蛋白、蛋白激酶C、calpain、磷脂酶C和A2、一氧化氮合酶）被過度激活；激活的蛋白與酶類啟動或參與細胞病理損傷，最終導致細胞死亡[4]。calpain在缺血性腦損傷中起著重要的作用而倍受關注，是近年來研究的熱點之一[5]。calpain是半胱氨酸異二聚體蛋白酶，由一個催化亞單元（80 kD）和一個調節(jié)亞單元（29 kD）組成，分為calpainⅠ（又稱μ-calpain）和calpainⅡ（m-calpain）兩種類型，二者的調節(jié)亞單元相同，催化亞單元不同，激活所需的Ca2+濃度不同，可分別被微摩爾和毫摩爾水平的Ca2+激活[6]。在生理狀態(tài)下，calpain以酶原的形式存在于細胞質中，在病理情況下（如缺血等），細胞內Ca2+超載，Ca2+與calpain催化區(qū)的特異性鈣調蛋白樣位點結合引起構象改變，從而使其激活[7]。激活后的calpain可水解關鍵的細胞骨架蛋白（如MAP2、spectrin、tubulin以及ankylin）而導致細胞死亡[8]。Yamashima等[9]研究發(fā)現(xiàn)猴子短暫性全腦缺血后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元內μ-calpain大量激活，激活后的μ-calpain可水解溶酶體膜連接蛋白（lamp-1），導致溶酶體破裂，導致水解酶大量釋放，造成神經(jīng)元壞死。激活后的calpain還可引起線粒體滲透性轉變（MTP），導致細胞死亡[10]。

以往一直認為calpain主要參與細胞壞死，但越來越多的證據(jù)表明它也在凋亡中也起著重要作用。Jordan等[11]研究發(fā)現(xiàn)鈣蛋白酶抑制劑calpeptin及MDL28170可顯著抑制培養(yǎng)的神經(jīng)膠質母細胞瘤細胞及海馬神經(jīng)元的凋亡，說明calpain參與了神經(jīng)元的凋亡的發(fā)生。以往的研究發(fā)現(xiàn)側腦室注射鈣蛋白酶抑制劑calpeptin可顯著減少MCAO術后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡，進一步證實calpain參與了腦缺血后神經(jīng)元凋亡[12]。calpain參與腦缺血后神經(jīng)元凋亡的機制目前尚不清楚，本研究發(fā)現(xiàn)calpeptin可減少MCAO術后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元caspase-3的表達，caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡的最重要的蛋白，因此推測calpeptin可能是通過抑制caspase-3的表達而抑制神經(jīng)元凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)calpain可切割pro-caspase-3和pro-caspase-9等，促進caspase-3的激活[13]。calpain可促進caspase-3的激活從而促進caspase-3介導的細胞凋亡[14]。Samantaray等[15]的研究發(fā)現(xiàn)：calpain抑制劑CX295可顯著抑制大鼠單側低氧缺血后caspase-3的表達，進一步研究表明pro-caspase-3可被calpain裂解，形成29 kDa的片段，該片斷很容易被進一步的裂解而激活。本實驗中，calpeptin抑制caspase-3的表達的具體機制不明，有待于進一步的研究。

[1] Sheldon R A，Sadjadi R，Lam M，et al.Alteration in downstream hypoxia gene signaling in neonatal glutathione peroxidase overexpressing mouse brain after hypoxia-ischemia[J].Developmental Neuroscience，2015，37（4-5）：398-406.

[2] Belayev L，Alonso O F，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture：neurological and pathological evaluation of an improved model[J].Stroke，1996，27 （9）：1616-1623.

[3] Bederson J B，Pitts L H，Tsuj M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic evaluation[J].Stroke，1986，17（3）：472-476.

[4] Suzuki S，Murotomi K，Nakajima Y，et al.Development of an artificial calcium-dependent transcription factor to detect sustained intracellular calcium elevation[J].ACS Synthetic Biology，2014，3 （10）：717-722.

[5] Ding Z J，Chen X，Tang X X，et al.Calpain inhibitor PD150606 attenuates glutamate induced spiral ganglion neuron apoptosis through apoptosis inducing factor pathway in vitro[J].PloS One，2015，10 （4）：e0123130.

[6] Park J Y，Jang S Y，Shin Y K，et al.Calcium-dependent proteasome activation is required for axonal neurofilament degradation[J].Neural Regen Res，2013，8（36）：3401-3409.

[7] Jordan J，Galindo M F，Miller R J.Role of calpain and interleukin-1-beta converting enzyme-like proteases in the beta-amyloid-induced death of rat hippocampal neurons in culture[J].J Neurochem，1997，68（4）：1612-1621.

[8] Peng S，Kuang Z，Zhang Y，et al.The protective effects and potential mechanism of Calpain inhibitor Calpeptin against focalcerebral ischemia-reperfusion injury in rats[J].Mol Biol Rep，2011，38（2）：905-912.

[9] Yamashima T，Tonchev A B，Tsukada T，et al.Sustained calpain activation associated with lysosomal rupture executes necrosis of the postischemic ca1 neurons in primates[J].Hippocampus，2003，13 （7）：791-800.

[10] Müller G J，Hasseldam H，Rasmussen R S，et al.Dexamethasone enhances necrosis-like neuronal death in ischemic rat hippocampus involving μ-calpain activation[J].Exp Neurol，2014，261（1）：711-719.

[11] Jordan J，Galindo M F，Miller R J.Role of calpain and interleukin-1-beta converting enzyme-like proteases in the beta-amyloidinduced death of rat hippocampal neurons in culture[J].J Neurochem，1997，68（4）：1612-1621.

[12] Li H，Zhang N，Sun G，et al.Inhibition of the group I mGluRs reduces acute brain damage and improves long-term histological outcomes after photothrombosis-induced ischaemia[J].ASN Neuro，2013，5（3）：195-207.

[13] Kim C，Yun N，Lee Y M，et al.Gel-based protease proteomics for identifying the novel calpain substrates in dopaminergic neuronal cell[J].J Biol Chem，2013，288（51）：36 717-36 732.

[14] Song Y J，Li D，Pan L P，et al.The suppression of epileptiform discharges in cultured hippocampal neurons is regulated via alterations in full-length tropomyosin-related kinase type B receptors signalling activity[J].The European Journal of Neuroscience，2014，40（3）：2564-2575.

[15] Samantaray S，Patel K S，Knaryan V H，et al.Calpain inhibition prevents ethanol-induced alterations in spinal motoneurons[J]. Neurochem Res，2013，38（8）：1734-1741.

醫(yī)學論文表與圖的寫作要求

一、制表的基本要求

1.重點突出，簡單明了，主謂分明，層次清楚。

2.結構完整，有自明性，表的內容不要與文字、插圖重復。

3.表中的量、單位、符號、縮略語等須與正文一致。

二、圖應具有自明性，即只看圖、圖題和圖例，不閱讀正文，就可理解圖意；內容不要與文字、表格重復；類型應與資料性質匹配。

1.線條圖要求線條均勻、主輔線分明，并使數(shù)軸上刻度值的標法符合數(shù)學原則。

2.照片圖要求有良好的清晰度和對比度，層次分明，反差適中，沒有雜亂的背景。

3.圖高度與寬度的比例一般掌握在5∶7左右。

4.圖中的量、單位、符號、縮略語等須與正文一致。

Effect of Calpain Inhibitor in Reducing Neuron Apoptosis of Hippocampal CA1 Section of the Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Model in Rats/

KUANG Zhong-shen，XU Hang，HUANG Zheng，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（29）：015-018

Objective：To study the influence and mechanism of calpain inhibitor calpeptin in neuron apoptosis of hippocampal CA1 section in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion.Method：128 health adult male SD rates were selected as the research animals.They were divided into the MACO group，the calpeptin group，the DMSO group and the sham group.The left middle cerebral artery（MCA） occlusion model was performed.2 hours after the left middle cerebral artery occlusion，recirculations of 6，12，24 hours and 48 hours were given to the rates.6，12，24 hours and 48 hours after the recirculations，the neurological functions of the rats were evaluated，immunohistochemistry was used to detect the expression of caspase-3 in hippocampal CA1 section and the neuronal apoptosis in hippocampal CA1 section was detected by the method of terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end-labelling（TUNEL）.Result：The differences in the indexes between the MCAO group and the MACO group were not statistically significant （P＞0.05）.The scores of neurological functions and the expression of caspase-3 in the calpeptin group were lower than those in the MCAO group and the MACO group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.12，24 hours and 48 hours after the recirculations，the situations of neuronal apoptosis in the calpeptin group were better than those in the MCAO group and the MACO group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Calpeptin can reduce the neuronal apoptosis of hippocampal CA1 section in rats with ischemia-reperfusion injury and the mechanism may be related to the inhibition of the expression of caspase-3.

Calpain； Ischemia-reperfusion injury； Apoptosis； Caspase-3

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.29.005

2015-07-03） （本文編輯：王利）

國家自然科學基金地區(qū)基金（81360203）

①石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 新疆 石河子 832008

匡重伸

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Medical School of Shihezi University，Shihezi 832008，China