魏桃英，汪釗，魏瑞鋒

1(浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 紹興，312000) 2(浙江工業(yè)大學(xué)，浙江杭州，31000)

黃酒不穩(wěn)定，主要是由非生物渾濁引起的，而非生物渾濁，一般認(rèn)為主要是由于酒體中的蛋白質(zhì)［1］或蛋白與多酚類(lèi)物質(zhì)(如單寧)相結(jié)合而引起的［2］或氧化作用、重金屬影響［3］。黃酒不穩(wěn)定主要表現(xiàn)在黃酒的冷渾濁與陳釀過(guò)程中或瓶裝加熱后出現(xiàn)沉淀物［4］。要提高它的穩(wěn)定性，必須降低酒體中蛋白質(zhì)的含量。首先從蛋白質(zhì)上著手，加入蛋白酶來(lái)分解原料與微生物中的蛋白質(zhì)，從而減少酒體中的蛋白質(zhì)。啤酒生產(chǎn)中已在用木瓜蛋白酶來(lái)提高啤酒的穩(wěn)定性。借鑒啤酒的方法把木瓜蛋白酶運(yùn)用到黃酒發(fā)酵中來(lái)。由于黃酒的pH值為3.7～4.5左右，本試驗(yàn)通過(guò)向黃酒發(fā)酵醪中添加一定比較的酸性蛋白酶，以期提高黃酒的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料

酸性蛋白酶，10萬(wàn)U/g;大米，市售;釀造用水，紹興地區(qū)自來(lái)水;安琪酵母(黃酒高活性干酵母)，安琪酵母股份有限公司;麥曲，會(huì)稽山生產(chǎn)。

1.2 主要儀器

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司，上海博迅儀器廠;生化培養(yǎng)箱BSP-150;酒精蒸餾儀一套;離心機(jī);pH-3C酸度計(jì)，上海精密科學(xué)上海雷磁儀器廠;722型分光光度計(jì)，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒釀造工藝流程

(1)大米→浸米→蒸飯→攤冷→投料→添加酸性蛋白酶→前發(fā)酵→后發(fā)酵→壓榨→過(guò)濾→殺菌→灌裝→貯存

(2)大米→浸米→蒸飯→攤冷→投料→前發(fā)酵→添加酸性蛋白酶→后發(fā)酵→壓榨→過(guò)濾→殺菌→灌裝→貯存。

1.3.2 操作要點(diǎn)

浸米:稱(chēng)取粳米15 kg于桶中，加水到浸沒(méi)米10 cm，浸米時(shí)間以氣溫來(lái)定，一般浸到米用手輕捻一下即能粉碎為止。浸米主要是為了讓大米吸水膨脹，蒸飯容易，一般根據(jù)米質(zhì)情況，浸漬24～48 h。

蒸飯:把浸好的米用紗布包好，進(jìn)行蒸汽蒸，蒸到飯粒疏松不糊，顆粒完整，不黏連結(jié)塊，成熟均勻一致，內(nèi)無(wú)白心生粒。

1.3.3 酒用酸性蛋白酶的添加方案

添加量0、5、10、15、20、25 U/g 各 5 個(gè)樣品試驗(yàn)，稱(chēng)量所需的蛋白酶與0.1%的黃酒活性干酵母，混勻后接種于蒸好的米飯中，另外所有條件都相同，麥曲加量為米的18%，水的加量為米的120%。酸性蛋白酶在添加前用50℃熱水活化30 min，每組做平行試驗(yàn)，取平均值。

投料后按黃酒生產(chǎn)工藝進(jìn)行操作。開(kāi)耙時(shí)，頭、二耙可視品溫的高低由開(kāi)耙人掌握，有案例經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為頭、二耙溫度之和不超過(guò)70℃(加酶后不超過(guò)63℃)。三、四耙則要結(jié)合感官檢查，通過(guò)聽(tīng)、看、摸、嘗，判斷發(fā)酵醪的成熟程度，及時(shí)開(kāi)耙和降溫，保證發(fā)酵正常進(jìn)行;四耙以后，每天搗耙2～3次，直至接近室溫。適當(dāng)攪拌可增加酒醅中的氧氣，提高酵母活力，抑制雜菌生長(zhǎng)，但應(yīng)注意減少酒精揮發(fā)，及時(shí)灌壇，進(jìn)行后發(fā)酵。前酵時(shí)間一般控制在5 d。進(jìn)入后發(fā)酵階段，應(yīng)保持低溫，一般品溫應(yīng)控制在15℃，后酵時(shí)間在15 d左右，前10天每天至少要攪拌開(kāi)耙1次，通入新鮮空氣，保持酵母活力，使酒體逐漸豐滿(mǎn)協(xié)調(diào)。

1.3.4 總糖的測(cè)定［5］

1.3.5 酒精度測(cè)定［5］

1.3.6 酸度與氨基酸態(tài)氮的測(cè)定［5］

1.3.7 酒樣穩(wěn)定性測(cè)定

(1)酒樣濁度的測(cè)定［6］:在可見(jiàn)分光光度計(jì)上，設(shè)定800 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，以澄清的空白同樣酒樣為參比，將待測(cè)定酒樣迅速搖勻測(cè)定透光率T，以1-T作為黃酒的濁度。

(2)酒樣的冷渾濁測(cè)定:取殺菌后的酒樣50 mL，在0℃冰箱中放置12 h，拿出后快速測(cè)定濁度。

(3)酒樣強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)［7］:以酒樣在0～4℃冰箱內(nèi)放置12 h，60℃烘箱中放置12 h，2次循環(huán)后，取出在常溫下800 nm處快速測(cè)定透光率T，1-T為其濁度。

(4)乙醇濁度測(cè)定［8］:在10 mL澄清酒樣加入5 mL無(wú)水乙醇，用混合器振蕩1 min，室溫放置2 h，取出后快速測(cè)定濁度。

1.3.8 黃酒發(fā)酵醪中酵母數(shù)的檢測(cè)

1.3.8.1 方法步驟

(1)稀釋:吸取10.0 mL樣品于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容后搖勻，即試樣。

(2)加樣:取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)板1塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上蓋玻片，用1 mL移液管滴1小滴試樣，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過(guò)多)，讓試樣利用液體的表面張力充滿(mǎn)計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余試樣。也可以將試樣直接滴加在計(jì)數(shù)區(qū)上(不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上試樣，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高)，然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)減弱光照的強(qiáng)度。靜置2 min。

(3)鏡檢計(jì)數(shù):用400倍顯微鏡觀察。調(diào)節(jié)顯微鏡使計(jì)數(shù)室清晰，計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格組成，按對(duì)角線(xiàn)方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格(即100小格)的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格組成的計(jì)數(shù)區(qū)(如圖2)，除數(shù)上述4個(gè)大方格外，還需數(shù)中央1個(gè)大方格的菌數(shù)(即80個(gè)小格)。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線(xiàn)上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線(xiàn)上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線(xiàn)不數(shù)下線(xiàn)，數(shù)左線(xiàn)不數(shù)右線(xiàn)，以減少誤差。即位于本格上線(xiàn)和左線(xiàn)上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線(xiàn)和右線(xiàn)上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)到母細(xì)胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2～3次(每次數(shù)值不應(yīng)相差過(guò)大，否則應(yīng)重新操作)，計(jì)算出1 mL菌懸液所含細(xì)胞數(shù)量。

(4)清洗:測(cè)數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。

黃酒發(fā)酵是多菌種發(fā)酵，利用形態(tài)與個(gè)體的大小來(lái)鑒別酵母菌。黃酒酵母菌細(xì)胞的形態(tài)通常有球形、卵圓形、橢圓形。比細(xì)菌的單細(xì)胞個(gè)體要大得多，一般為1～5 μm ×5～30 μm。酵母菌無(wú)鞭毛，不能游動(dòng)。在放大400倍的顯微鏡下，細(xì)菌只能看到很小的一個(gè)點(diǎn)，它與黃酒酵母菌很容易區(qū)別。至于霉菌一般情況下，它是以菌絲為單位，呈長(zhǎng)管狀的，很易與黃酒酵母菌區(qū)分。

1.3.8.2 計(jì)算

16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)板:

2 結(jié)果與討論

2.1 投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒的酒精度影響

在黃酒釀造投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶后對(duì)黃酒的酒精度生成量的影響見(jiàn)圖1。

從圖1可知，使用酸性蛋白酶比例越高，則發(fā)酵初期的酒度相對(duì)也越高。在投料時(shí)添加酸性蛋白酶，相當(dāng)于在培菌階段添加。添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒前4天內(nèi)的酒精度影響較大，這是因?yàn)?，在投料時(shí)加入酸性蛋白酶，可以快速地分解原料中的蛋白質(zhì)，分解出游離的氨基酸等小分子物質(zhì)，為酵母生長(zhǎng)提供充足的必需營(yíng)養(yǎng)物，有利于酵母快速繁殖［7］。增加酒精發(fā)酵的能力，表現(xiàn)為發(fā)酵醪的酒度明顯提高。第1天的各指標(biāo)檢測(cè)時(shí)間是28 h左右。

圖1 投料時(shí)加入酸性蛋白酶酒精度的變化Fig.1 Add the change of the acid protease alcohol feeding

2.2 投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒發(fā)酵醪酵母數(shù)的影響

在投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶后對(duì)黃酒發(fā)酵醪中酵母數(shù)的生成量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 投料時(shí)加入酸性蛋白酶黃酒酵母數(shù)變化情況Fig.2 Feeding when adding acid protease，the change of the number of yellow wine yeast

從圖2分析可知，在黃酒生產(chǎn)中通過(guò)增加酸性蛋白酶的添加量，可以使酵母細(xì)胞數(shù)在1 d后增加，到2 d時(shí)其酵母數(shù)量可翻倍，而沒(méi)有加酸性蛋白酶的醪液中酵母數(shù)2 d檢測(cè)的數(shù)值與添加酸性蛋白酶1 d檢測(cè)的數(shù)值相當(dāng)，而且也增加到頂峰。黃酒發(fā)酵醪中酵母數(shù)增加得多，產(chǎn)生酒精的量也相應(yīng)增加，這與圖1的數(shù)值相吻合。當(dāng)然由于酵母數(shù)檢測(cè)時(shí)，取樣有系統(tǒng)誤差與偶然誤差存在，不同的酸性蛋白酶添加量與酵母生成量是否有比例關(guān)系這一點(diǎn)不能下結(jié)論，但加入酸性蛋白酶確實(shí)可以增加酵母的數(shù)量。

2.3 投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒發(fā)酵醪中酸度的影響

投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶后對(duì)黃酒發(fā)酵醪中酸度的影響如圖3所示。

圖3 投料時(shí)加入酸性蛋白酶發(fā)酵醪酸度的變化Fig.3 Feeding when adding acid protease fermentation mash acidity change

研究之初加入酸性蛋白酶的量為10，20，30，40，50U/g，發(fā)酵到7天，加入酶量為40、50 U/g的二只酒檢測(cè)酸度為8.5 g/L，酸度超過(guò)GB/T13662-2008黃酒國(guó)標(biāo)7.5 g/L，且有酸臭氣，出現(xiàn)了酸敗現(xiàn)象。因此減少用酶量，適當(dāng)降低開(kāi)耙溫度，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在投料時(shí)添加不同酸性蛋白酶的酸度變化情況如圖3所示，在試驗(yàn)范圍內(nèi)添加的酸性蛋白酶量越多，產(chǎn)生的酸度相對(duì)也高，這一方面可能是因?yàn)榍鞍l(fā)酵添加酸性蛋白酶，使醪液的氮源增多，氨基酸含量豐富，不但有利于酵母菌的繁殖與生長(zhǎng)，也有利于其他雜菌的生長(zhǎng)與繁殖，同時(shí)此時(shí)醪液酒精度較低，不能抑制雜菌生長(zhǎng)，前期產(chǎn)生的生酸菌增加，發(fā)酵后期造成酸敗，同時(shí)黃酒發(fā)酵是開(kāi)放性發(fā)酵，酵母菌與乳酸菌是共存的，加入蛋白酶有利于乳酸菌的生長(zhǎng)，所以醪液中酸度比沒(méi)加酸性蛋白酶的黃酒醪液要高。

2.4 投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒發(fā)酵醪中糖含量的影響

投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒發(fā)酵醪中糖生成量的影響如表1所示。

表1 投料時(shí)加入酸性蛋白酶發(fā)酵醪糖度的變化Table 1 Feeding when adding acid protease fermentation mash sugar changes

從表1可知，前發(fā)酵期加入不同量的酸性蛋白酶，酒樣總糖含量略有增加，這可能是因?yàn)樗嵝缘鞍酌阜纸庠陷^徹底，醪液營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富;另外加酸性蛋白酶的醪液中霉菌數(shù)量比沒(méi)加的醪液霉菌數(shù)量多，霉菌分泌出的總的糖化酶與液化酶較多，從而有利于淀粉的分解，使總糖稍高于沒(méi)加酸性蛋白酶的黃酒醪液。加入適量酸性蛋白酶可以使麥曲的糖化力升高，可能是因?yàn)獒劸圃现械牡矸蹖?duì)糖化性淀粉有吸附作用，加入酸性蛋白酶可以降低吸附能力［9］。加入酸性蛋白酶使糖度略有上升，從2.1得出的結(jié)論可知，加入適量的酸性蛋白酶使酒精度上升，這是因?yàn)槠咸烟亲鳛榫凭a(chǎn)生的反應(yīng)前體，如果前體物質(zhì)葡萄糖的數(shù)量大，反應(yīng)后剩余的葡萄糖的量也相對(duì)較多。

2.5 投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒理化指標(biāo)的影響

投料時(shí)添加不同量的酸性蛋白酶，發(fā)酵結(jié)束時(shí)黃酒理化指標(biāo)如表2所示。

表2 投料時(shí)加入酸性蛋白酶發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)Table 2 Feeding when adding acid protease fermentation at the end of the physical and chemical indicators

2.6 前發(fā)酵后添加不同量的酸性蛋白酶進(jìn)行發(fā)酵釀造試驗(yàn)分析

投料5 d前發(fā)酵后加入不同量的酸性蛋白酶，進(jìn)行發(fā)酵，只是加入酸性蛋白酶的時(shí)間不同，另外都與投料時(shí)加入酸性蛋白酶的操作相同。到發(fā)酵結(jié)束時(shí)對(duì)其理化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，前發(fā)酵后添加不同量的酸性蛋白酶在黃酒發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)如表3所示。

表3 前發(fā)酵后加入酸性蛋白酶發(fā)酵結(jié)束時(shí)理化指標(biāo)Table 3 before fermentation after adding acid protease fermentation at the end of the physical and chemical indicators

從表2與表3檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，投料時(shí)加入酸性蛋白酶與前發(fā)酵5 d后加入酸性蛋白酶到發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩者理化指標(biāo)的差別不大，總的來(lái)說(shuō)酒精度、酸度、氨基酸態(tài)氮、非糖固形物生成量與加入酸性蛋白酶的量成正比，對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響最明顯，對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，不加酶的氨基酸態(tài)氮含量為0.33，添加25 U/g酶的氨基酸態(tài)氮含量為0.56，氨基酸態(tài)氮含量增加了70%，酒精度增加9%，酸度增加了30%，總糖增加了40%，非糖固形物含量增加了13%。從本次研究數(shù)據(jù)分析可知，除了表2前發(fā)酵加入25 U/g酶的非糖固形物比沒(méi)加酶的增加了18.1%，另外的檢測(cè)數(shù)值都相差不多。從理論上來(lái)講，黃酒用酸性蛋白酶的最適作用溫度是30℃，在投料時(shí)加入的效果比前發(fā)酵后加入的效果好。因?yàn)楹蠼蜏囟瓤刂圃?5℃左右，這有可能會(huì)影響酸性蛋白酶的活性。在投料時(shí)加入酸性蛋白酶更加方便些，開(kāi)耙次數(shù)多有利于酶與物料接觸，使反應(yīng)均勻，如果在后酵時(shí)加入又多了一道工序，所以結(jié)合生產(chǎn)情況。在投料時(shí)加入與前酵后(發(fā)酵5 d后)加入兩者相比，只要控制好溫度，還是在投料時(shí)加入比較好。

2.7 添加酸性蛋白酶對(duì)發(fā)酵釀造的酒樣穩(wěn)定性的影響

不同時(shí)間段加入的酸性蛋白酶釀成的酒經(jīng)過(guò)濾后用3種方法來(lái)檢測(cè)酒樣的穩(wěn)定性，檢測(cè)結(jié)果如表4、表5所示。

表4 投料時(shí)加入不同量的酸性蛋白酶酒樣穩(wěn)定性比較Table 4 Feeding with different amount of acid protease liquor stability

表5 后發(fā)酵時(shí)加入不同量的酸性蛋白酶酒樣穩(wěn)定性比較Table 5 After fermentation when adding different amount of acid protease liquor stability

分析表4與表5數(shù)據(jù)可知，加入酸性蛋白酶的酒樣，原始濁度總的趨勢(shì)是隨著酶量的增加而增加，沒(méi)加酶的酒樣原始濁度最低。這種情況主要是由于加入酸性蛋白酶使酒體內(nèi)的固形物增多造成的。從冷渾濁、強(qiáng)化試驗(yàn)、乙醇濁度試驗(yàn)3種方法檢測(cè)數(shù)據(jù)可知，添加10、15、20 U/g酸性蛋白酶釀成的酒樣濁度相對(duì)都低。所以酸性蛋白酶的加入量在10～20 U/g較為適宜。不同時(shí)間段添加蛋白酶量，反映出相同的規(guī)律。這說(shuō)明在投料時(shí)加入與前酵后加入，對(duì)酒樣的非生物穩(wěn)定性影響不大，這可能是由于養(yǎng)醅時(shí)間較長(zhǎng)，酸性蛋白酶有充分的反應(yīng)時(shí)間，而生產(chǎn)中實(shí)際釀造時(shí)間與之相比要短一些，因此投料時(shí)加入酸性蛋白酶效果更好。

3 小結(jié)

酸性蛋白酶添加過(guò)量易使黃酒醪酸敗。酸性蛋白酶加入50U/g，開(kāi)頭耙溫度36℃，結(jié)果不到8 d發(fā)酵醪就酸敗了，酸度大于8.5g/L，經(jīng)鏡檢后發(fā)現(xiàn)桿菌大量出現(xiàn)，而酵母數(shù)只有0.5億/mL。這有可能是因?yàn)榘l(fā)酵溫度過(guò)高，來(lái)不及散熱，使酵母衰敗過(guò)速。在減少酶量的同時(shí)也降低了開(kāi)耙溫度，溫度為33℃開(kāi)頭耙。這樣發(fā)酵醪沒(méi)有整批酸敗的現(xiàn)象發(fā)生。由于開(kāi)頭耙的溫度比大生產(chǎn)的低2%～3%。投料時(shí)加入酸性蛋白酶與前發(fā)酵5 d后加入酸性蛋白酶到發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩者理化指標(biāo)的差別不大，總的來(lái)說(shuō)酒精度、酸度、氨基酸態(tài)氮、非糖固形物生成量與加入酸性蛋白酶的量成正比，對(duì)氨基酸態(tài)氮的影響最明顯。通過(guò)冷混濁與強(qiáng)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入10～20 U/g的蛋白酶的強(qiáng)化濁度比原酒降低了0.3左右，冷混濁的沉淀量比原酒明顯減少。這說(shuō)明黃酒的穩(wěn)定性有一定提高。通過(guò)發(fā)酵的不同時(shí)期加入相同量的酸性蛋白酶對(duì)黃酒穩(wěn)定性沒(méi)有多大的影響，但從黃酒的理化指標(biāo)數(shù)據(jù)分析可知，投料時(shí)與前發(fā)酵后不同時(shí)間加入酸性蛋白酶對(duì)非糖固形物有影響。根據(jù)生產(chǎn)的實(shí)際情況，在投料時(shí)加入與前酵后(發(fā)酵5 d后)加入兩者相比只要控制好溫度還是在投料時(shí)加入比較好，本次課題的研究目的是黃酒的穩(wěn)定性，所以從本次黃酒穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果可知在發(fā)酵時(shí)加入酸性蛋白酶添加量在10～20 U/g之間比較合適，結(jié)合試驗(yàn)數(shù)據(jù)與企業(yè)的經(jīng)濟(jì)成本兩方面考慮，選用15U/g的酸性蛋白酶為最好。

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