蔡國林，徐銘乾，李秋，王珊珊，杜祖波，陸健

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)4(山東魯花集團(tuán)有限公司，山東萊陽，265200)

黃曲霉毒素是一類主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的帶有一個(gè)氧雜萘鄰?fù)鸵粋€(gè)雙呋喃環(huán)的強(qiáng)毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物［1］。目前已經(jīng)鑒定出的黃曲霉毒素有20多種，而黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)是糧食中最常見的，也是毒性最大的，被世界衛(wèi)生組織定為1A類致癌物質(zhì)［2］。

AFB1在糧食中的存在嚴(yán)重威脅著動(dòng)物以及人體的健康，研究高效、安全降解AFB1已成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)。在各種AFB1去除方法中，由于物理法和化學(xué)法存在破壞糧食的營養(yǎng)物質(zhì)成分或造成化學(xué)物質(zhì)殘留和影響適口性等不足，目前生物脫毒普遍被認(rèn)為是最有前途的方法［3-4］。生物脫毒是指毒素分子上的毒性基團(tuán)被微生物或是其代謝產(chǎn)物分解破壞，同時(shí)產(chǎn)生無毒降解產(chǎn)物的過程［5］。在自然界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括細(xì)菌，真菌(含酵母)在內(nèi)的多種微生物能夠吸附真菌毒素或是分泌降解真菌毒素的物質(zhì)，這些微生物的脫毒機(jī)理主要有:菌體細(xì)胞對(duì)毒素的吸附作用和發(fā)酵產(chǎn)生的酶對(duì)毒素的降解作用。

在前期研究中，我們篩選到1株不但能明顯抑制黃曲霉生長，且能高效降解AFB1的安全菌株，目前已保藏至中國普通微生物菌種保藏管理中心，命名為解淀粉芽孢桿菌CGMCC-9021。對(duì)解淀粉芽孢桿菌CGMCC-9021降解AFB1的特性研究發(fā)現(xiàn)，AFB1的降解不是依賴菌體吸附，而是由于其代謝產(chǎn)生的胞外活性物質(zhì)，這種活性物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)［6］。本研究將通過硫酸銨沉淀、陰離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離純化該活性物質(zhì)，并通過質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行鑒定，為今后的高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。同時(shí)，采用熒光色譜技術(shù)初步分析裂解酶對(duì)AFB1的降解機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌CGMCC-9021由江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室分離，并保藏至中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 10 g/L，pH 7.0。

1.3 發(fā)酵液制備及硫酸銨沉淀

解淀粉芽孢桿菌CGMCC-9021經(jīng)活化后，接種至培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min后，取上清液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀。4℃，10 000 r/min離心10 min，將各個(gè)部分沉淀蛋白用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)復(fù)溶，透析過夜，之后加入4 μg/mL的 AFB1，使其最終含量為100 ng，最終質(zhì)量濃度達(dá)到20 μg/L。37℃，200 r/min振蕩反應(yīng)72 h，測定各個(gè)部分沉淀蛋白對(duì)AFB1的降解效果，選取降解效果最明顯的部分作為活性物質(zhì)的蛋白粗提液。

1.4 陰離子交換色譜

透析后的蛋白粗提液通過0.22 μm微孔濾膜過濾。將過濾后的蛋白溶液，上樣于HiPrep 16/10 DEAE FF離子交換柱(預(yù)裝柱)，用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L、pH 7.0)沖洗，然后用含1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L、pH 7.0)進(jìn)行恒梯度洗脫，流速5 mL/min，每管收集2 mL。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以280 nm吸收值為縱坐標(biāo)繪圖。并收集主要吸收峰對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液，測定其對(duì)AFB1的降解效果。

1.5 凝膠過濾色譜

收集陰離子交換色譜后檢測有AFB1降解能力的蛋白質(zhì)溶液，上樣于Superdux 75 10/300GL凝膠過濾層析柱(預(yù)裝柱)，用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L、pH 7.0)進(jìn)行沖洗，流速0.5 mL/min，每管收集1 mL。以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以280 nm吸收值為縱坐標(biāo)繪圖。并收集主要吸收峰對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液，測定其對(duì)AFB1的降解效果。最后，收集具有降解AFB1活性的部分，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE鑒定和質(zhì)譜分析。

1.6 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍(lán)G250法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 Tricine-SDS-PAGE

Tricine-SDS-PAGE 檢測方法參照孫雪文等［7］，凝膠制作采用3層不連續(xù)膠的系統(tǒng)，先灌下邊的分離膠和夾層膠，然后鋪水層，膠凝固后，除去水層，灌制上面的濃縮膠，小心插入梳子，靜置。內(nèi)槽加入負(fù)極電泳緩沖液，外槽加入正極電泳緩沖液，開始時(shí)電壓為40 V，待樣品完全離開樣品孔后，70 V恒壓電泳至結(jié)束。將膠放入固定液(50%甲醇，10%乙酸)中固定30 min后染色1.5 h，脫色過夜。

1.8 質(zhì)譜鑒定(MALDI-TOF/TOF)

取Tricine-SDS-PAGE膠上目標(biāo)條帶，進(jìn)行手動(dòng)切膠，將挖取的蛋白點(diǎn)凝膠轉(zhuǎn)移至EP管中，加入200 μL脫色液(30%乙腈/0.1%TFA的碳酸氫銨溶液)，振蕩脫色至膠粒呈無色。棄掉脫色液，膠粒用50 μL的乙腈脫水2次，得到白色膠粒。每個(gè)脫水后的膠粒加入5 μL胰蛋白酶溶液，置于4℃吸收30～60 min，使膠粒充分吸脹，結(jié)束后吸出未被吸收的酶液，加入20 μL、25 mmol/L碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37℃水浴酶解20 h。酶解液吸出后加到新的EP管中，原管中加入20 μL、60%乙腈/0.1%TFA 萃取液，超聲15 min，凍干備用。

凍干的酶解樣品用 3 μL、0.1%TFA復(fù)溶，將0.7 μL CHCA基質(zhì)溶液與0.7 μL酶解液先后點(diǎn)在Anchorchip靶板中心的疏水區(qū)。再用2 μL，0.1%TFA進(jìn)行脫鹽。一級(jí)質(zhì)譜采用正離子模式，二級(jí)質(zhì)譜分析幾個(gè)強(qiáng)度較高的一級(jí)圖譜峰，用Mascot軟件(http://www.matrixscience.com)在NCBInr數(shù)據(jù)庫中對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索匹配，Mascot分值大于59即可認(rèn)定物質(zhì)鑒定有效［8］。

1.9 AFB1降解產(chǎn)物的熒光光譜分析

將 25 μL AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，975 μL 無菌的降解AFB1的活性物質(zhì)溶液加入棕色反應(yīng)瓶中，使得混合溶液中AFB1的質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL，37℃避光反應(yīng)0，1，3 d。3倍體積于反應(yīng)液的三氯甲烷進(jìn)行液相萃取AFB1，之后加入1.5 mL 50%的甲醇水溶液振蕩溶解，在365 nm的激發(fā)波長下測定不同反應(yīng)條件下的 AFB1熒光強(qiáng)度［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 硫酸銨沉淀

取100 mL 發(fā)酵液分別進(jìn)行以下梯度的硫酸銨分級(jí)沉淀:0% ～20%，20% ～40%，40% ～60%，60% ～80%和80%～完全飽和，測定各個(gè)部分沉淀蛋白對(duì)AFB1的降解效果，結(jié)果見圖1。

圖1 硫酸銨分級(jí)沉淀各部分對(duì)AFB1的降解作用Fig.1 Ammonium sulfate precipitation classification effect on degrading AFB1

從圖1(a)中可以發(fā)現(xiàn)0% ～20%，20% ～40%，40%～60%沉淀區(qū)間蛋白溶液都具有較高的降解AFB1活性，說明降解AFB1的活性物質(zhì)在0% ～60%的沉淀區(qū)間內(nèi)，由于沉淀區(qū)間過寬會(huì)造成雜蛋白的過多帶入，所以需要對(duì)該區(qū)間進(jìn)一步的分級(jí)，以求獲得最優(yōu)化的沉淀區(qū)間。對(duì)0%～60%的沉淀區(qū)間進(jìn)一步分級(jí)沉淀，測定各個(gè)部分沉淀蛋白對(duì)AFB1的降解效果，結(jié)果如圖1(b)所示。從圖1(b)中可以發(fā)現(xiàn)0%～40%硫酸銨沉淀區(qū)間的蛋白溶液具有更強(qiáng)的降解AFB1能力，說明活性物質(zhì)在該區(qū)間得到更好的分離。而且隨著硫酸銨沉淀度的不斷增加，0% ～50%、0%～60%沉淀區(qū)間蛋白對(duì)AFB1的降解活性急劇下降，幾乎檢測不到相應(yīng)活性，說明降解AFB1的活性物質(zhì)不能夠耐受高濃度的鹽溶液，在該環(huán)境下使其失去降解AFB1的活性。

2.2 陰離子交換色譜

將40%硫酸銨沉淀的蛋白粗提液通過0.22 μm微孔濾膜后，采用HiPrep 16/10 DEAE FF色譜柱(柱體積為20 mL，上樣量為30 mL)進(jìn)行分離純化，用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)沖洗，然后用含1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)進(jìn)行恒梯度洗脫，設(shè)定流速為5 mL/min，每管收集2 mL，繪制對(duì)應(yīng)的OD280圖譜如圖2所示。

圖2 HiPrep 16/10 DEAE FF色譜柱色譜洗脫圖譜Fig.2 Chromatography of active substance on HiPrep 16/10 DEAE FF

從圖2可以看出蛋白粗提液經(jīng)離子交換色譜層析后得到2個(gè)色譜峰，且獲得了較好的分離效果。收集離子交換色譜峰1、2對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液，分別命名為L1、L2。分別加入 4 μg/mL 的 AFB1，使其最終含量為100 ng，37 ℃，200 r/min振蕩反應(yīng) 72 h，測定L1、L2對(duì)AFB1的降解情況。其中，L2具有較高的降解AFB1的活性，其降解率為80.3%，L1的降解率為17.0%。因此，降解AFB1的活性物質(zhì)主要集中于第2個(gè)色譜峰，收集第2個(gè)色譜峰，并對(duì)其蛋白濃度、體積進(jìn)行測定，儲(chǔ)存于4℃以備用。

2.3 凝膠過濾色譜分析

將離子交換色譜的L2(第2個(gè)色譜峰)所收集的蛋白溶液通過0.22 μm微孔濾膜后，采用Superdux 75 10/300GL(柱體積為25 mL，上樣量為0.5 mL)，用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)進(jìn)行沖洗，設(shè)定流速為0.5 mL/min，每管收集1 mL，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，以280 nm吸收值為縱坐標(biāo)繪圖，得到對(duì)應(yīng)的OD280圖譜如圖3所示。通過凝膠過濾色譜的進(jìn)一步分離純化將原有的L2色譜峰分離為4個(gè)色譜峰，且獲得了較好的分離效果。收集凝膠過濾色譜峰1、2、3、4 對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)溶液，分別命名為 N1、N2、N3、N4。分別加入4 μg/mL的 AFB1，使其最終含量為100 ng，37 ℃，200 r/min振蕩反應(yīng) 72 h，測定其對(duì)AFB1的降解效果，其中N3具有明顯降解AFB1的活性，其降解率為32.4%。收集第3個(gè)色譜峰，并對(duì)其蛋白濃度、體積進(jìn)行測定，儲(chǔ)存于4℃以備用。

圖3 Superdux 75 10/300GL色譜柱色譜洗脫圖譜Fig.3 Chromatography of active substance on Superdux 7510/300GL

2.4 Tricine-SDS-PAGE分析

收集分離純化的各個(gè)步驟中具有降解AFB1活性的成分進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果如圖4所示。

圖4 Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.4 The map of Tricine-SDS-PAGE

從Tricine-SDS-PAGE圖譜上可以看出5個(gè)泳道中均具有1條共有的條帶，而且N3只有該條帶本身，說明其可能為降解AFB1的活性物質(zhì)，且分子質(zhì)量為27 ku左右。

2.5 降解AFB1活性物質(zhì)的質(zhì)譜鑒定

對(duì)Tricine-SDS-PAGE泳道5中的蛋白條帶1挖點(diǎn)后進(jìn)行酶切，然后將其進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜(MALDITOF/TOF)分析和蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBInr)檢索，匹配結(jié)果見表1，質(zhì)譜分析見圖5。該蛋白點(diǎn)鑒定結(jié)果為lytic enzyme L27［Bacillus subtilis］(登錄號(hào)為 gi|3986320)，其匹配總得分為494，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量(Mr)為27 479，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)為6.65。劉玉嶺［10］對(duì)具有抗菌能力的解淀粉芽孢桿菌的活性物質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離純化，獲得lytic enzyme L27和beat-1，3-1，4-glucanase兩種均具有抗菌活性的蛋白。裂解酶主要作用于肽聚糖上的糖苷鍵和肽鍵，其中酰胺酶和肽鏈內(nèi)切酶水解肽側(cè)鏈和交聯(lián)橋之間的氨基或肽鍵連接，同時(shí)因?yàn)殡木厶堑孽０愤B接和氨基糖之間的β-1，4糖苷鍵連接在細(xì)菌種間往往是保守的，所以其相應(yīng)的裂解酶就具有更廣的裂解譜［11］。目前關(guān)于裂解酶的研究主要是集中于抗菌的研究中，該酶對(duì)于AFB1等毒素裂解作用的研究未見報(bào)道。

表1 質(zhì)譜分析中匹配的肽段序列信息Table 1 The information of match peptide sequence by mass spectrometry analysis

圖5 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.5 The analysis maps of mass spectrometry

2.6 解淀粉芽孢桿菌裂解酶降解AFB1的可能機(jī)理

AFB1本身具有熒光特性，在紫外光照射下可發(fā)出藍(lán)色或紫色熒光。而其熒光特性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相關(guān)。AFB1經(jīng)過解淀粉芽孢桿菌裂解酶的不同時(shí)間處理后，其熒光特性發(fā)生了明顯的改變，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，AFB1的熒光特性不斷降低，也即其降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，熒光特性消失，如圖6所示。Lee等［12］發(fā)現(xiàn)改變AFB1的戊酮環(huán)、呋喃環(huán)及內(nèi)酯環(huán)上取代基的結(jié)構(gòu)，不會(huì)影響AFB1熒光特性，而內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)打開后，AFB1熒光特性消失;另外對(duì)AFB1以及失去內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)后的AFD1的致突變性和毒性進(jìn)行對(duì)比研究，通過Ames實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFD1的致突變能力幾乎消失，比AFB1降低450倍，而雞胚的毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFD1的毒性降低18倍，所以內(nèi)酯環(huán)為AFB1的主要毒性結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)的改變也使得AFB1的毒性和致突變能力大大降低。另外，篩選降解AFB1的解淀粉芽孢桿菌CGMCC-9021時(shí)采用的培養(yǎng)基是以香豆素為唯一碳源，香豆素是所有黃曲霉毒素的基本分子結(jié)構(gòu)，能夠利用香豆素生長的微生物也能分解AFB1，而內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)是香豆素與AFB1共有的可能改變的結(jié)構(gòu)。因此解淀粉芽孢桿菌裂解酶對(duì)AFB1的作用位點(diǎn)可能是內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，如圖7所示，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

圖6 解淀粉芽孢桿菌裂解酶對(duì)AFB1熒光特性的影響Fig.6 Effect of lytic enzyme on emission spectra of AFB1

圖7 解淀粉芽孢桿菌裂解酶對(duì)AFB1的可能作用位點(diǎn)Fig.7 Possible action site of lytic enzyme on AFB1biodegradation

3 結(jié)論

通過硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE FF陰離子交換層析和Superdux 75凝膠過濾層析等一系列的蛋白質(zhì)分離純化以及Tricine-SDS-PAGE和質(zhì)譜鑒定獲得降解AFB1的活性物質(zhì)為一種分子質(zhì)量(Mr)約為27ku，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(pI)為6.65的解淀粉芽孢桿菌裂解酶(lytic enzyme)。通過熒光光譜對(duì)經(jīng)過解淀粉芽孢桿菌裂解酶不同時(shí)間處理后AFB1進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，AFB1的熒光強(qiáng)度不斷降低，也即改變了AFB1原有結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯環(huán)，熒光特性消失，與此同時(shí)其毒性消失，實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的真正降解。

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