周潔靜，侯銀臣，劉旺旺，李桂誼，楊公明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東廣州，510640)

免疫活性肽是指一類(lèi)存在于生物體內(nèi)具有免疫功能的多肽。該類(lèi)肽結(jié)構(gòu)多樣，是一種細(xì)胞信號(hào)傳遞物質(zhì)，它通過(guò)內(nèi)分泌、旁分泌、神經(jīng)分泌等多種作用方式行使其生物學(xué)功能，溝通各類(lèi)細(xì)胞間的相互聯(lián)系。

近年來(lái)，有從各種微生物、動(dòng)物、植物、乳源蛋白中采用酶解方法獲得免疫活性肽的報(bào)道，如雞蛋清［1-2］、牛乳酪蛋白［3］、魚(yú)蛋白［4-5］、大豆蛋白［6-7］、小麥蛋白［8］、玉米胚芽蛋白［9］等。研究較多的免疫活性肽有抗菌肽、阿片肽、胸腺肽、酪蛋白磷酸肽、血管活性腸肽等［10］。酶制劑的種類(lèi)及酶解條件對(duì)產(chǎn)物的成分、含量、活性起決定性作用。

胎盤(pán)含有免疫球蛋白、膠原蛋白、雌激素、腎上腺分泌的激素、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等生物活性因子，具有抗氧化、免疫、修復(fù)組織損傷等功能作用。

我國(guó)是世界第一養(yǎng)羊大國(guó)，羊資源豐富，每年可以開(kāi)發(fā)利用的羊胎盤(pán)潛藏量高達(dá)450萬(wàn)個(gè)，但是絕大多數(shù)都廢棄扔掉，加工量不到3%，造成巨大的資源浪費(fèi)，且污染了環(huán)境。本研究在提取羊胎盤(pán)活性物的基礎(chǔ)上，以單獨(dú)刺激指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用復(fù)合酶解技術(shù)利用羊胎盤(pán)提取殘余物制備免疫活性肽，并在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊胎盤(pán)，山羊分娩的羊胎盤(pán);風(fēng)味蛋白酶(3.97×103U/g)，中性蛋白酶(4.69×103U/L)，購(gòu)自諾維信中國(guó)銷(xiāo)售代理廣州明曜公司;ICR小鼠，5～6周齡小鼠，購(gòu)自偉倫體校動(dòng)物試驗(yàn)研究中心;RPMI(roswell park memorial institute)-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，購(gòu)自上海立菲生物技術(shù)有限公司;D-Hank’s洗液，購(gòu)自上海立菲生物技術(shù)有限公司;青霉素、鏈霉素混合液，購(gòu)自上海立菲生物技術(shù)有限公司;小牛血清，購(gòu)自上海立菲生物技術(shù)有限公司;MTT，購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;臺(tái)盼蘭粉末，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司;ConA，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

PHS-3D pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;KDN-04A凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;日立氨基酸分析儀，L-8800日本日立有限公司;85-2A恒溫磁力攪拌器，常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠;SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司;Anke TDL-5-A離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;SW-CJ-1F凈化工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，無(wú)錫耐思生物科技有限公司;2300-001L多模式微孔板檢測(cè)儀，美國(guó)Perkin Elmer公司;CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Shellab公司;XSP-15C倒置生物顯微鏡，上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料的預(yù)處理

(1)對(duì)分娩的羊胎盤(pán)立即收集并低溫超速凍保藏，入-20℃冷庫(kù)備用。(2)羊胎盤(pán)冷凍粉碎、液氮打漿。(3)pH 7.5的磷酸緩沖液在料液比1∶5、溫度20℃的條件下攪拌提取2 h，在4 000 r/min，4℃條件下離心20 min，收集上清液，沉淀為羊胎盤(pán)下腳料作為制備免疫肽的酶解原料。

1.3.2 免疫肽制備工藝

羊胎盤(pán)原料→冷凍粉碎→液氮打漿→提取水溶性蛋白→離心收集羊胎盤(pán)提取殘余物→復(fù)合酶解→滅酶→離心→酶解液

1.3.3 酶解工藝條件的單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 不同酶添加量對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

酶添加量設(shè)為 2 000，4 000，6 000，8 000，10 000 U/g蛋白，按中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比1∶1，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度50℃，pH 7.0，料液比1∶50(g∶mL)進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解液的單獨(dú)刺激指數(shù)。

1.3.3.2 不同復(fù)配比對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比設(shè)為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，按酶添加量 4 000 U/g 蛋白，酶解時(shí)間3 h，酶解溫度 50℃，pH 7.0，料液比 1∶50(g∶mL)進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解液的單獨(dú)刺激指數(shù)。

1.3.3.3 不同酶解時(shí)間對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

酶解時(shí)間設(shè)為 2，3，4，5，6 h，按酶添加量 4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比1∶1，酶解溫度50℃，pH 7.0，料液比1∶50(g∶mL)進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解液的單獨(dú)刺激指數(shù)。

1.3.3.4 不同酶解溫度對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

酶解溫度設(shè)為 40，45，50，55，60℃，按酶添加量4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比1∶1，酶解時(shí)間3 h，pH 7.0，料液比 1∶50(g∶mL)進(jìn)行酶解，測(cè)定酶解液的單獨(dú)刺激指數(shù)。

1.3.3.5 pH值對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的最適pH值均為7.0［11-12］，因此酶解pH選擇2種酶的最適pH 7.0。

1.3.3.6 料液比對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

料液比設(shè)為1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，1∶70 g 蛋白/ml，按酶添加量4 000 U/g蛋白，中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比1∶1，酶解時(shí)間3h，酶解溫度50℃，pH 7.0，測(cè)定酶解液的單獨(dú)刺激指數(shù)。

1.3.4 酶解工藝條件的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在考察了酶添加量、復(fù)配比、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比等單因素的基礎(chǔ)上，通過(guò)Box-Behnken design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，選定酶添加量、復(fù)配比、酶解時(shí)間3個(gè)因素作為目標(biāo)變量，試驗(yàn)因素及水平如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and Levels for the traial

1.3.5 小鼠脾細(xì)胞增值活性測(cè)定

參考MTT法，并對(duì)其進(jìn)行一定改良后用于實(shí)驗(yàn)。無(wú)菌獲取小鼠脾細(xì)胞，活細(xì)胞比例95% 以上，調(diào)整濃度至2×106個(gè)/mL;在96孔板中設(shè)空白組、對(duì)照組和樣品組，3組分別為細(xì)胞溶液、細(xì)胞 +ConA溶液、細(xì)胞 +ConA+樣品溶液。各組均設(shè)3個(gè)平行，置于含5%CO2，37℃中培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前4 h加入10 μL無(wú)菌MTT溶液，繼續(xù)孵育至結(jié)束;取出培養(yǎng)板，充分離心后，棄上清，加入150 μL DMSO溶液充分溶解結(jié)晶;于517 nm波長(zhǎng)處采用酶標(biāo)儀測(cè)其OD值。細(xì)胞增值活性以單獨(dú)刺激指數(shù)(SI)表示。

1.3.6 水解度(DH)的測(cè)定［13-15］

采用茚三酮比色法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)各值均為3個(gè)平行數(shù)據(jù)的均值，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件繪圖并作方差和顯著性分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊胎盤(pán)提取殘余物的生化指標(biāo)(表2)

表2 羊胎盤(pán)提取殘余物Table 2 Composition of the precipitation

2.2 單因素試驗(yàn)的細(xì)胞增值活性

檢測(cè)樣品免疫活性時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組SI值為0.044±0.002。

2.2.1 不同酶添加量對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

由圖1可知，羊胎盤(pán)酶解液對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性，在2 000～8 000 U/g隨著酶添加量的增加而增強(qiáng)。但當(dāng)酶添加量超過(guò)8 000 U/g蛋白時(shí)，SI值卻下降。

圖1 不同酶添加量對(duì)SI值的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on stimulation index

這可能是由于酶添加量小于8 000 U/g蛋白時(shí)，底物與酶的濃度比仍未飽和，增加酶添加量，可加快酶解進(jìn)程，產(chǎn)生更多的羊胎盤(pán)免疫活性肽。而當(dāng)酶添加量繼續(xù)增大到10 000 U/g蛋白時(shí)，底物濃度相對(duì)較低，酶分子過(guò)于飽和，所以水解程度變化不大，免疫活性肽的量不再增加。相反，過(guò)量的酶會(huì)把具有免疫活性的肽進(jìn)一步水解為更小分子質(zhì)量肽或氨基酸，導(dǎo)致最終產(chǎn)物的目標(biāo)免疫活性SI值下降。可知，復(fù)合酶加入最佳值為8 000 U/g蛋白。

2.2.2 不同復(fù)配比對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

由圖2顯示，隨著中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比的增大，其SI值先緩慢下降，當(dāng)復(fù)配比為1∶1時(shí)，SI值最少為0.045。繼續(xù)增大復(fù)配比，SI值快速上升。當(dāng)復(fù)配比為2∶1時(shí)，SI值最大達(dá)0.170。復(fù)配比與酶解液的SI值并沒(méi)明顯的相關(guān)關(guān)系，這可能與蛋白酶的酶切位點(diǎn)有關(guān)。

圖2 不同復(fù)配比對(duì)SI值的影響Fig.2 Effect of complex interactions on stimulation index

2.2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的SI值先增大后減少，當(dāng)酶解時(shí)間為5 h時(shí)，產(chǎn)物的SI值達(dá)最高值為0.181。酶解時(shí)間控制5 h內(nèi)，酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)逐漸被分裂成肽，反應(yīng)體系中存在大分子蛋白，具有免疫活性的肽和氨基酸，這些成分在復(fù)合蛋白酶的作用下發(fā)生變化，這個(gè)過(guò)程比較復(fù)雜，存在多種轉(zhuǎn)化方式，但是酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，SI值下降，可能由于隨著酶解的進(jìn)行，復(fù)合蛋白酶切斷了具有高免疫活性的肽鏈，導(dǎo)致產(chǎn)物的SI值下降。因此需要合理控制酶解反應(yīng)的時(shí)間。

圖3 不同酶解時(shí)間對(duì)SI值的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on stimulation index

2.2.4 不同酶解溫度對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

由圖4可知，酶解溫度為45℃時(shí)，酶解產(chǎn)物具有較高的SI值。這與中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的最適溫度有關(guān)。中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的最適溫度分別為45℃和55℃［11-12］，而在此溫度下，產(chǎn)物的 SI值較高，45℃時(shí)，SI值最高?？赡苤行缘鞍酌父欣谘蛱ケP(pán)免疫活性肽的生成，因此在中性蛋白酶最適酶解溫度下，產(chǎn)物的活性最高。同時(shí)，考察復(fù)配比對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響時(shí)，當(dāng)中兩者的復(fù)配比為2∶1或3∶1時(shí)，產(chǎn)物的 SI值均高于復(fù)配比為 1∶3或1∶2，進(jìn)一步也說(shuō)明中性蛋白酶更有利于羊胎盤(pán)免疫活性肽的制備。

圖4 不同酶解溫度對(duì)SI值的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on stimulation index

2.2.5 不同料液比對(duì)小鼠脾細(xì)胞增值活性的影響

由圖5 可知，料液比在 1∶30 ～1∶50(g∶mL)時(shí)，SI值總體呈上升;單料液比大于1∶50(g∶mL)時(shí)，SI值開(kāi)始下降?？赡茈S著料液比的增加，底物逐漸由濃稠狀變稀釋?zhuān)欣诘鞍酌概c底物充分接觸，提高酶解效率，產(chǎn)生更多具有免疫活性的肽，但是隨著料液比越來(lái)越大，底物過(guò)于稀釋?zhuān)罅康乃炊黾恿说鞍酌概c底物的接觸難度，導(dǎo)致體系酶解不完全，蛋白質(zhì)難以被分解成具有免疫活性的肽。何佳易［16］等研究表明酶解程度與底物質(zhì)量濃度有關(guān)，為本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供理論依據(jù)。

圖5 不同料液比對(duì)SI值的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on stimulation index

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化羊胎盤(pán)免疫活性肽的工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表3，利用Design Expert8.0對(duì)表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合及對(duì)模型進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表4所示。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案以及響應(yīng)值Table 3 Experiment design and result of response surface method analysis

表4 響應(yīng)面方差分析表Table 4 Variance analysis of regression equation

續(xù)表4

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到單獨(dú)刺激指數(shù)SI對(duì)酶添加量、復(fù)配比和酶解時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程:單獨(dú)刺激指數(shù)=-0.16+3.04A+0.071B+0.18C-1.03AB+8.31AC+7.66BC-1.07A2-0.022B2-0.028C2。該模型的P＜0.000 1，表明模型方程極顯著，不同處理間的差異極顯著;失擬項(xiàng)P=0.329 2＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明殘差由隨機(jī)誤差引起;模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.950 7，即該模型能解釋95.07%的響應(yīng)值變化;復(fù)相關(guān)系數(shù)為 R=0.950 7，說(shuō)明該模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)羊胎盤(pán)免疫肽。

由顯著性檢驗(yàn)可知，模型的單項(xiàng)A，二次項(xiàng)A2、B2、C2，交互項(xiàng)AC極顯著;單項(xiàng) C，交互項(xiàng) AB顯著;單項(xiàng)B，交互項(xiàng)BC不顯著。各因素對(duì)單獨(dú)刺激指數(shù)影響的大小依次為酶添加量(A)、酶解時(shí)間(C)、復(fù)配比(B)。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)交互因素分析

從所得響應(yīng)面分析圖中可以看出響應(yīng)值與各影響因素的關(guān)系，分析出各因素之間的相互作用，如圖6～圖8所示。

由圖6～圖8響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖分析可知，復(fù)配比和酶解時(shí)間交互作用對(duì)單獨(dú)刺激指數(shù)的影響最顯著，其次酶添加量和復(fù)配比交互作用對(duì)單獨(dú)刺激指數(shù)的影響顯著。相比較而言，復(fù)配比和酶解時(shí)間的交互作用稍弱。

圖6 酶添加量和復(fù)配比交互作用對(duì)單獨(dú)刺激指數(shù)影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)Fig.6 Response surface and contour plot of stimulation index of enzyme addition and complex interactions

2.3.3 模型驗(yàn)證試驗(yàn)

從上述回歸方程可知，制備羊胎盤(pán)免疫肽最優(yōu)工藝條件為:酶添加量2 007.65 U/g，復(fù)配比1.75∶1，酶解時(shí)間3.7 h?？紤]到實(shí)際操作將其工藝條件優(yōu)化為:酶添加量2 500 U/g，復(fù)配比1.75∶1，酶解時(shí)間4 h。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，酶解液的水解度平均值為39.60%，單獨(dú)刺激指數(shù)平均值為0.261 2，理論值與實(shí)際值的誤差不超過(guò)1.21%，結(jié)果表明，該模型可以較好地反映出羊胎盤(pán)免疫肽的最佳制備條件。

圖7 酶添加量和酶解時(shí)間交互作用對(duì)單獨(dú)刺激指數(shù)影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)Fig.7 Response surface and contour plot of stimulation index of enzyme addition and time

圖8 復(fù)配比和酶解時(shí)間交互作用對(duì)單獨(dú)刺激指數(shù)影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)Fig.8 Response surface and contour plot of stimulation index of complex interactions and time

3 結(jié)論

通過(guò)酶解法制備羊胎盤(pán)免疫肽，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)制備羊胎盤(pán)免疫肽的酶添加量、復(fù)配比和酶解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，得到酶解制備羊胎盤(pán)免疫肽的最佳工藝條件為:酶添加量2 500 U/g蛋白，復(fù)配比1.75∶1，酶解時(shí)間4 h。在此條件下，酶解液的水解度平均值為39.60%，單獨(dú)刺激指數(shù)平均值為0.261 2，較陽(yáng)性對(duì)照增加494%。結(jié)果表明通過(guò)優(yōu)化提高羊胎盤(pán)酶解產(chǎn)物的免疫活性。

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