鄭曉杰，林勝利，聶小華，許丹

1(溫州科技職業(yè)學(xué)院(浙江溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院)，浙江溫州，325006)

2(浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州，310014)

雞骨是肉雞加工過程中產(chǎn)生的大宗副產(chǎn)品，約含12%的蛋白質(zhì);其酶解液常用作食品調(diào)味料基料，廣泛應(yīng)用于方便食品、膨化食品與肉制品等生產(chǎn)中。但由于雞骨酶解液風(fēng)味不足，使用前需要進(jìn)行風(fēng)味調(diào)制，而美拉德反應(yīng)是蛋白酶解物增香的有效手段。安廣杰等［1］將雞骨架酶解液添加一定的輔料后進(jìn)行美拉德反應(yīng)制得優(yōu)良的雞肉香精;孫紅梅等［2］應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)感官評價方法優(yōu)化得到雞骨素美拉德反應(yīng)的工藝參數(shù)。已有研究表明，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物肉味強(qiáng)度比傳統(tǒng)的煮雞或烤雞的肉味強(qiáng)80～100倍［3］。

目前雞骨資源的研究多集中于酶解工藝［4-5］、酶解液美拉德反應(yīng)工藝［1-2］及揮發(fā)性物質(zhì)分析［6］等方面，而雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中非揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)研究很少。本文以雞骨酶解液為原料，在不同溫度下進(jìn)行雞骨酶解液與木糖之間的美拉德反應(yīng)，研究其反應(yīng)產(chǎn)物中游離氨基酸、肽類等非揮發(fā)性物質(zhì)的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷凍雞骨架，市售，去除表層肌肉與脂肪;木瓜蛋白酶(60萬U/g)、胰酶(1400U/g)、中性蛋白酶(4.7萬U/g)，購于河南華森食品配料有限公司。

SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美國MD公司;紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;CR22N/CR21N高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀，德國SYKAM公司;Waters 600高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞骨酶解液的制備

稱取一定量的雞骨，加入1∶1.5(g∶mL)水后于130℃高壓蒸煮20 min，勻漿后于50℃和自然pH下進(jìn)行復(fù)合酶酶解，其中復(fù)合酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶(1∶2∶1)，添加量為1 g原料添加2 200 u;酶解3.5 h后于100℃下處理15 min，冷卻，離心去沉淀，上清液即為雞骨酶解液。

1.2.2 雞骨酶解液的美拉德反應(yīng)

取雞骨酶解液50 mL，加入木糖2.0 g，分別于不同溫度下反應(yīng)90 min，即為雞骨酶解液的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.2.3 pH的測定

采用數(shù)字酸度計直接測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中pH值。

1.2.4 褐變程度的測定

將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋25倍后，于420 nm處測定吸光值。

1.2.5 自由氨基的測定

采用鄰苯二甲醛法(oPA法)［7］。將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍后，取0.1 mL稀釋液加入3 mL 0.05 mol/L硼砂緩沖溶液(含0.8 mg/mL OPA，1%SDS，2 μg/mL β-巰基乙醇)，混勻，室溫下反應(yīng) 3 min，于340 nm下測定吸光度。以賴氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸光值轉(zhuǎn)換為賴氨酸濃度當(dāng)量。

1.2.6 游離氨基酸的分析

取10 mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，加入等體積10%三氯乙酸，過濾沉淀，取濾液，采用SYKAM S-433D全自動氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.2.7 肽分子量分布的分析

將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5倍后，微孔濾膜過濾。采用Waters 600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器和Empower工作站GPC軟件)測定。色譜柱:TSK-gel 2000 SWXL 300 mm ×7.8 mm;柱溫:30℃;流動相:乙腈/水/三氟乙酸(45∶55∶0.1，體積比);流速:0.5 mL/min;檢測波長:220 nm。分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為細(xì)胞色素C、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件中Duncan法進(jìn)行各組之間的顯著性分析(P＜0.05)，采用Origin8.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中pH值和褐變程度的影響

已有研究表明，美拉德反應(yīng)過程中可消耗游離氨基基團(tuán)和產(chǎn)生甲酸、乙酸等酸性物質(zhì)，從而導(dǎo)致反應(yīng)體系pH值下降［8］，因此pH值是衡量美拉德反應(yīng)程度的重要參數(shù)。圖1表明，雞骨酶解液經(jīng)美拉德反應(yīng)后，其pH值顯著下降，由起始的6.09降至4.77～4.45，但各美拉德反應(yīng)產(chǎn)物之間不存在顯著性差異。這可能是因?yàn)槠鹗紁H值為弱酸性，美拉德反應(yīng)程度緩慢，無法體現(xiàn)出不同溫度下雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物pH之間的差異。

褐變程度是檢測美拉德反應(yīng)進(jìn)展的另一個重要指標(biāo)，常用420 nm處吸光度來表示，A420nm值增加表明美拉德反應(yīng)最后階段褐色素的產(chǎn)生。由圖1可知，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中A420nm值隨著反應(yīng)溫度的增加而快速增加，與反應(yīng)溫度之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性;當(dāng)反應(yīng)溫度為100℃時，A420nm值比對照組增加了7倍以上。Lan等亦認(rèn)為溫度很大程度上影響著大豆肽-木糖美拉德反應(yīng)體系的褐變程度［9］。

圖1 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中pH值和褐變程度的影響Fig.1 Effect of temperature on pH and browning in Maillard reaction products

2.2 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中自由氨基的影響

美拉德反應(yīng)中蛋白質(zhì)、肽類或氨基酸的α-或ε-氨基與還原糖類發(fā)生共價結(jié)合，消耗的自由氨基越多，反應(yīng)越徹底。由圖2可知，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中自由氨基含量發(fā)生顯著降低，其含量損失隨著反應(yīng)溫度增加而增加;溫度高于90℃，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)比較徹底，自由氨基由起始的388.23 mmol/L降至 300～310 mmol/L，損失率分別為20.22%(90℃)和21.79%(100 ℃)。JIANG 等［7］研究酪蛋白-半乳糖美拉德反應(yīng)時亦發(fā)現(xiàn)，在pH5～6、95℃下反應(yīng)2 h，自由氨基損失率較低，約為15%～20%;只有當(dāng)pH＞9.0時自由氨基才被大量消耗，這主要因?yàn)閴A性、高溫的環(huán)境更有利于美拉德反應(yīng)進(jìn)行。此外，雞骨酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中自由氨基含量的降低與反應(yīng)溫度、褐變程度的增加均存在正相關(guān)性，劉蒙蒙［10］、ZENG［11］等亦報道了相似結(jié)論。

圖2 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中自由氨基的影響Fig.1 Effect of temperature on amino groups in Maillard reaction products

2.3 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中游離氨基酸的影響

游離氨基酸是美拉德反應(yīng)的重要底物，其參與美拉德反應(yīng)的活性各有不同。由表1可知，雞骨酶解液中共檢出15種游離氨基酸，總量為14 404.2 mg/L。經(jīng)美拉德反應(yīng)后游離氨基酸總量顯著降低至7 271.2～7 756.7 mg/L，這主要源于氨基酸和糖類之間的交聯(lián)反應(yīng)，其中損失變化較大的游離氨基酸依次是丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和亮氨酸，這說明上述4種游離氨基酸具有較強(qiáng)的美拉德反應(yīng)活性，且總體上其損失率與反應(yīng)溫度呈現(xiàn)正相關(guān)性，經(jīng)100℃反應(yīng)90 min后分別降低了97.57%、67.60%、57.08%和50.95%。而天冬氨酸和甘氨酸含量隨著反應(yīng)溫度的增加而增加，尤其是在100℃反應(yīng)體系中分別增加了51.37%和19.19%，這可能是因?yàn)樵谌跛?、高溫下肽降解作用生成的游離氨基酸大于美拉德反應(yīng)消耗的游離氨基酸;LAN等［9］認(rèn)為，還原糖的存在改變了肽的結(jié)構(gòu)，有助于肽在高溫下降解生成氨基酸。此外，雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)中半胱氨酸、纈氨酸、組氨酸和賴氨酸等含量變化不大。但趙謀明等研究發(fā)現(xiàn)，雞肉蛋白肽-葡萄糖美拉德反應(yīng)體系中精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸降解率最高［12］。

表1 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中游離氨基酸的影響 單位:mg/LTable 1 Effect of temperature on free amino acids in Maillard reaction products

2.4 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中肽分子量分布的影響

蛋白酶解液中存在著不同分子量肽段，不僅發(fā)生熱降解產(chǎn)生美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，而且直接參與美拉德反應(yīng)［13］。由表2可知，雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中分子量＞500 Da的5個組分含量均發(fā)生顯著下降，同時伴隨著分子量＜500 Da的組分含量明顯增加。據(jù)此推測弱酸條件下美拉德反應(yīng)體系中肽段的熱降解作用遠(yuǎn)大于交聯(lián)作用;趙謀明、劉平等亦報道了不同分子量肽段在美拉德反應(yīng)過程中存在著熱降解情況［12，14］。對不同溫度的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行比較，隨著反應(yīng)溫度增加，分子量＞5000 Da的組分略有增加，3000～5000 Da和2000～3000 Da的組分表現(xiàn)出先降后增加，1000～2000 Da和500～1000 Da組分含量逐步降低，分子量＜500 Da的組分則呈現(xiàn)逐步增加，這說明溫度越高肽段更易發(fā)生美拉德反應(yīng)，雞骨酶解液中各肽段與木糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的能力不同，其中1000～2000 Da和500～1000 Da組分具有較高的美拉德反應(yīng)活性，該肽段可能含有較高反應(yīng)活性的末端氨基酸。

表2 溫度對雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)體系中肽分子量分布的影響Table 2 Effect of temperature on peptides in Maillard reaction products

3 結(jié)論

隨著反應(yīng)溫度的增加，雞骨酶解液-木糖美拉德反應(yīng)程度增加，pH明顯降低，褐變程度的增加、自由氨基含量的減少均與溫度呈現(xiàn)正相關(guān)性;經(jīng)美拉德反應(yīng)后大部分游離氨基酸和肽段等含量顯著下降，其中丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸和亮氨酸等氨基酸和1 000～2 000 Da和500～1 000 Da組分具有較高的美拉德反應(yīng)活性。

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