杜曉明 李寧 宋春青 方佩華

人源性促甲狀腺激素受體抗體Fab段抗體庫(kù)的構(gòu)建

杜曉明 李寧 宋春青 方佩華

目的 通過(guò)噬菌體表面展示技術(shù)，構(gòu)建人源性促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）Fab片段抗體庫(kù)。方法 從甲狀腺功能亢進(jìn)癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞抽提總RNA，PCR法擴(kuò)增免疫球蛋白分子輕鏈κ、λ基因及重鏈Fd基因。構(gòu)建輕鏈文庫(kù)及組合文庫(kù)。一個(gè)隨機(jī)的組合文庫(kù)在噬菌體表面表達(dá)。結(jié)果 從外周血單個(gè)核細(xì)胞中抽提得到總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫(kù)。PCR法擴(kuò)增了大小約為680 bp的輕鏈κ、λ基因及重鏈Fd基因，并構(gòu)建了庫(kù)容為1.32×105基因抗體庫(kù)(輕鏈庫(kù))和庫(kù)容為2.28×105Fab抗體庫(kù)（組合文庫(kù)）。Fab組合文庫(kù)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，在輔助噬菌體M13K07的輔助下，擴(kuò)增得到噬菌體抗體庫(kù)。結(jié)論 噬菌體表面展示技術(shù)可成功構(gòu)建人源性TRAb Fab片段組合文庫(kù)。

噬菌體表面展示技術(shù)；人源性單克隆抗體；促甲狀腺激素受體抗體Fab

組合抗體庫(kù)是繼雜交瘤技術(shù)之后，抗體研究領(lǐng)域取得的一大進(jìn)展。該技術(shù)依賴于噬菌體表面展示技術(shù)的建立。噬菌體表面展示技術(shù)通過(guò)富集篩選抗體、抗原，可在短期內(nèi)篩選到較高親和力的抗體。來(lái)源于免疫庫(kù)的抗體，其特性偏向于免疫的特定靶抗原。因此，通過(guò)宿主的免疫系統(tǒng)，雖然能夠獲得高親和、高特異的抗體，但為了獲得與體內(nèi)相似的成熟過(guò)程，相對(duì)于每個(gè)單個(gè)的抗原，需要構(gòu)建新的抗體庫(kù)[1]。

促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）是自身免疫性甲狀腺疾病中的特異性抗體。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的TRAb Fab噬菌體抗體庫(kù)為免疫抗體庫(kù)，有利于獲得高豐度的TRAb Fab表達(dá)基因。

1 材料和方法

1.1 材料 大腸桿菌XL1.Blue為本室保存。促甲狀腺激素（TSH）-N為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科制備。Horizon 58Gel凝膠電泳儀為美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品。噬菌粒pComb3Hss為海軍總醫(yī)院周麗君教授惠贈(zèng)。輔助噬菌體M13K07為New England公司產(chǎn)品。化學(xué)感受態(tài)XL1-Blue為北京全世金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。血液總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自Biotech公司。限制性內(nèi)切酶SacⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、SpeⅠ、T4DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物公司。引物由Invitrogen公司合成。

1.2 RNA提取、引物和PCR擴(kuò)增 選取3例天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院門診確診為Graves病的患者（TRAb＞0.04 IU/L）為研究對(duì)象。取患者抗凝外周血，用血液總RNA快速提取試劑盒提取外周血RNA，以O(shè)lig（dT）為引物，合成cDNA第一鏈，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以Coronella等[3]報(bào)道的設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)一組兼并引物，該引物以人抗體可變區(qū)胚系基因序列為基礎(chǔ)，上游引物位于可變區(qū)的第一骨架區(qū)（FR1），輕鏈下游引物位于恒定區(qū)（CL），重鏈下游引物位于鉸鏈區(qū)（hinge region）。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為:95℃變性3min，循環(huán)中模板變性30 s，κ、λ輕鏈及重鏈基因退火溫度分別為 62℃、56℃、58℃，時(shí)間 30 s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，繼之72℃延伸10 min，4℃終止。

PCR 引物：（1）輕鏈（λ）可變區(qū)引物 VL4B：5'-CCG（GAGCTC）CAGCCTGTGCTGACTCARYC-3'；（2）輕鏈（λ）恒定區(qū)引物 CL2：5'-CGCCG（TCTAGA）ACTATGAACATTCTGTAG-3'；（3）輕鏈（κ）可變區(qū)引物 VK1B：5'-CCG（GAGCTC）GACATCCRGDTGACCCAGTCTCC-3'；（4）輕鏈（κ）可變區(qū)引物 VK9B：5'-CCG（GAGCTC）GATATTGTGMTGACBCAGWCTCC-3'；（5）輕鏈（κ）恒定區(qū)引物CK1Z：5'-GCGCCG（TCTAGA）ACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGG GCGATCTCA-3'；（6）重鏈（H）可變區(qū)引物 VH22B：5'-CCG（CTCGAG）CAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG-3'；（7）重鏈（H）恒定區(qū)引物 CG1Z：5'-GCATGT（ACTAGT）TTTGTCACAAGATTTGGG-3'。

1.3 凝膠電泳 應(yīng)用1%甲醛變性的瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性、DNA條帶以及限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)物。

1.4 噬菌體Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建

1.4.1 構(gòu)建輕鏈庫(kù) 經(jīng)SacⅠ和XbaⅠ酶切的噬菌粒載體pComb3Hss和輕鏈PCR產(chǎn)物由T4DNA連接酶連接為環(huán)狀，經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌XL1-Blue中。擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌，提取質(zhì)粒得到輕鏈庫(kù)載體DNA。

1.4.2 輔助噬菌體敏感宿主菌的制備 接種XL1-Blue于 LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基瓊脂平板，挑取單菌落接種，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取輔助噬菌體M13K07貯存液1μl加入到以上EP管中，孵育，觀察菌斑。挑取輔助噬菌體M13K07單個(gè)空斑接種菌液擴(kuò)增。制備好的輔助噬菌體M13K07，滴定不同稀釋度的平板，計(jì)數(shù)空斑數(shù)并計(jì)算滴度。

1.4.3 TRAb Fab片段噬菌體抗體庫(kù)的制備 經(jīng)XhoⅠ和SpeⅠ酶切重鏈Fd段PCR產(chǎn)物和輕鏈庫(kù)，連接后轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌經(jīng)適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)大培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，加入約1012空斑形成單位（pfu）的輔助噬菌體13K07，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，次日4000 r/min（r=7 cm）離心菌液收集上清，加入PEG8000 及NaCl，振蕩促溶9000 r/min（r=7cm）離心，棄上清，用2ml1%BSA-PBS懸浮噬菌體沉淀，收集上清，加疊氮鈉（NaN3）至0.2%，得到噬菌體抗體庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 輕鏈和Fd段基因的擴(kuò)增結(jié)果 提取外周血細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR擴(kuò)增輕鏈和Fd段的基因。

（1）RNA凝膠電泳顯示5個(gè)樣本中，第4個(gè)RNA條帶清晰，28S、18S亮度之比大于1:1，無(wú)RNA降解。測(cè)OD值約等于1.8，證明RNA無(wú)降解，無(wú)蛋白質(zhì)污染，可作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（圖1）。

圖1 外周血總RNA甲醛變性凝膠電泳圖

（2）1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增IgG1的重鏈與κ、λ輕鏈基因片段的長(zhǎng)度約為680 bp，符合理論預(yù)期值（圖 2，3）。

圖2 IgG1λ、κ輕鏈基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物

圖3 IgG1重鏈Fd基因引物的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 噬菌體Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建和鑒定

2.2.1 輕鏈文庫(kù)構(gòu)建 抽提輕鏈重組噬菌粒L+P經(jīng)SacⅠ/XbaⅠ雙酶切，電泳結(jié)果顯示兩條長(zhǎng)度分別約為3 700 bp與680 bp的DNA條帶；經(jīng)XhoⅠ單酶切，電泳結(jié)果顯示為一條約為4 300 bp的DNA條帶，符合理論預(yù)期值（圖4）。

圖4 輕鏈重組噬菌粒L+P克隆的單、雙酶切鑒定的電泳結(jié)果

輕鏈文庫(kù)推算轉(zhuǎn)化子數(shù)為:1.47×l05cfu。從1μl平板中挑取10個(gè)菌落，分別擴(kuò)增后提取質(zhì)粒。10份質(zhì)粒均用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切處理。其中有9份可以切下約680 bp的片段，故輕鏈的插入率為90%，實(shí)際庫(kù)容為:1.47×105×90%=1.323×105。

將已構(gòu)建的輕鏈庫(kù)噬粒DNA用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切，回收純化經(jīng)XhoⅠ和SpeⅠ酶切重鏈Fd段PCR產(chǎn)物和輕鏈文庫(kù)，連接后轉(zhuǎn)化。組合文庫(kù)的插入率為60%，組合文庫(kù)Fab的庫(kù)容量為:3.8×105×60%=2.28×105cfu。

2.2.2 Fab組合文庫(kù)構(gòu)建 在輔助噬菌體M13K07的輔助下超感染XL1-Blue，次日在Amp平板上可見菌落生長(zhǎng)（圖5）。挑取菌落后抽提質(zhì)粒，電泳顯示用SacⅠ/XbaⅠ以及XhoⅠ/SpeⅠ雙酶切，可釋放出約680bp的插入片段，單用XhoⅠ沒(méi)有釋放出插入片段，將閉合狀態(tài)的抗體庫(kù)質(zhì)粒切開為大約4700bp的片段（圖 6）。

圖5 含有輕鏈和Fd的重組子轉(zhuǎn)化菌斑

圖6 噬菌體Fab抗體庫(kù)單、雙酶切鑒定電泳結(jié)果

3 討論

免疫抗體庫(kù)的構(gòu)建來(lái)源于不同種類的經(jīng)抗原免疫的個(gè)體。從該類抗體庫(kù)中便于篩選到針對(duì)某一特定抗原的特異性抗體。國(guó)內(nèi)有學(xué)者通過(guò)制備免疫抗體庫(kù)得到有一定親和力及特異性的抗核抗體Fab段[2]。本實(shí)驗(yàn)需要篩選的TRAb是自身免疫性甲狀腺疾病中的特異性抗體，因此選擇了免疫抗體庫(kù)。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的TRAb Fab噬菌體抗體庫(kù)基因來(lái)源于自身免疫性疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，有利于高豐度TRAb表達(dá)基因的獲得。對(duì)TRAb Fab噬菌體抗體庫(kù)的菌落的隨機(jī)檢測(cè)，應(yīng)用SacⅠ/XbaⅠ以及XhoⅠ/SpeⅠ雙酶切，可釋放出約680 bp的插入片段，證實(shí)有輕鏈和重鏈Fd段插入片段存在，單用XhoⅠ沒(méi)有釋放出插入片段，將閉合狀態(tài)的抗體庫(kù)質(zhì)粒切開為大約4700bp的片段，說(shuō)明構(gòu)建抗體庫(kù)成功。重組產(chǎn)物中包含目的基因，表明庫(kù)容的有效性良好。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的化學(xué)法轉(zhuǎn)化噬菌粒，簡(jiǎn)單易行，感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue庫(kù)容量在108數(shù)量級(jí)，考慮抗體庫(kù)基因來(lái)源的高豐度性以及庫(kù)容良好的有效性，該庫(kù)容可以滿足下一步高親和力抗體的篩選。

本實(shí)驗(yàn)參考Biotherapeutics實(shí)驗(yàn)室Coronella等[3]的設(shè)計(jì)，選擇性地合成了一組引物。實(shí)驗(yàn)合成的引物為兼并引物，盡量包括抗體重鏈IgG各亞型，以及抗體輕鏈κ型和λ型。利用上游和下游不同的引物組合，均擴(kuò)增出了相應(yīng)的片段，保證了所需抗體庫(kù)的多樣性。

重組抗體與傳統(tǒng)的單克隆抗體在基本功能方面是一致的。而重組抗體能夠在體外批量生產(chǎn)，在制備過(guò)程中更加靈活，在制成后有更多機(jī)會(huì)優(yōu)化，能更方便的制作、篩選、成熟，并且能夠選擇性進(jìn)行結(jié)構(gòu)性的改變，這在傳統(tǒng)的單克隆技術(shù)中是不可能實(shí)現(xiàn)的[1]。

單克隆抗體在診斷、治療和靶向給藥系統(tǒng)方面均有潛在的應(yīng)用，不僅可應(yīng)用于細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物導(dǎo)致的感染，還可應(yīng)用于淋巴細(xì)胞惡性腫瘤、組織配型、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫以及微生物血清分型[4]。

TRAb可導(dǎo)致Graves病，在不同甲狀腺功能亢進(jìn)癥中，TRAb有何作用，TRAb是否可用于Graves病復(fù)發(fā)、胎兒或新生兒甲狀腺毒癥的預(yù)測(cè)，以及臨床Graves眼病的臨床評(píng)估，還需要在臨床實(shí)踐中進(jìn)一步探索[5]。因此有必要了解TRAb的結(jié)構(gòu)、功能以及臨床診斷、治療方面的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)利用噬菌體表面展示技術(shù)構(gòu)建了人源性TRAb Fab段噬菌體抗體庫(kù)。TRAb為異質(zhì)性抗體[6]。因此可能通過(guò)促甲狀腺激素受體抗原，在后續(xù)的工作中進(jìn)一步篩選得到甲狀腺刺激性抗體。甲狀腺刺激性抗體可用于Graves病診斷技術(shù)中的定量檢測(cè)，而甲狀腺刺激阻斷性抗體作為阻斷性抗體可用于探討自身免疫性疾病的免疫治療，為自身免疫性疾病的診斷以及免疫治療提供新的思路。

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Construction of Fab fragment library of human thyrotrophin receptor antibody

Du Xiaoming*，Li Ning，Song Chunqing，F(xiàn)ang Peihua.*Department of Endocrinology，Tianjin 4th Center Hospital，Tianjin 300140，China

Fang Peihua，Email：raysinomail@163.com

Objective To constructa Fab fragment library of human thyrotrophin receptor antibody（TRAb）using phagedisplay technology.M ethods TotalRNAwasisolated from peripheralbloodmononuclear cells of patientswith hyperthyroidism.Human immunoglobulinκ/λ light chain and heavy chains Fd genes were amplified by PCR.A lightchain library and a combinatorial librarywere constructed respectively.A random combinatorial librarywasexpressed on thesurfaceof filamentousphage.Results cDNA library was harvested successfully by reverse transcription technology from totalRNA ofperipheralbloodmononuclear cells.Human immunoglobulin 680 bp κ/λ lightchain and heavy chain Fd geneswere obtained by PCR.The size ofκ light chain library was 1.32×105.The actual diversity of Fab combinatorial library was 2.28×105.The Fab combinatorial librarywere transformed in E.coliXL1 Blue.The transformered cellswere infected with M13K07 helper phage to amplify phageantibody Fabs.Conclusion A human TRAb Fab fragmentphage combinatorial library can be constructed by phage surface display technology.

Phage display technology；Humanmonoclonalantibodies；Thyrotrophin receptor antibody Fab

（Int JEndocrinol Metab，2015，35：238-241）

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2015.04.006

天津市衛(wèi)生局科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2013KR04)

300140 天津市第四中心醫(yī)院內(nèi)分泌科（杜曉明，宋春青）；300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科（李寧，方佩華）

方佩華，Email：raysinomail@163.com

2015-02-24）