鐘益寧，柳 歡，吳詩云，張 焱，覃鳳梅，譚佩珍，劉華青，黃澤金

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530299；2.防城港市萬景林業(yè)有限公司，廣西防城港 538021)

經(jīng)濟(jì)林下種植示范牛大力的總黃酮含量跟蹤分析

鐘益寧1，柳 歡1，吳詩云1，張 焱1，覃鳳梅1，譚佩珍1，劉華青2，黃澤金2

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧 530299；2.防城港市萬景林業(yè)有限公司，廣西防城港 538021)

摘要[目的]建立經(jīng)濟(jì)林下示范種植牛大力藥材的總黃酮含量跟蹤測定的比色方法。[方法]以蘆丁為對(duì)照品，利用鹽酸鎂粉顯色法對(duì)3批次采集的牛大力藥材總黃酮的含量進(jìn)行測定，跟蹤分析其總黃酮含量的變化。[結(jié)果]在最大吸收533 nm波長下進(jìn)行測定，蘆丁在濃度0.5～1.8 mg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為91.30%～93.12%，RSD為0.92%～1.27%；3批次總黃酮含量分別為1.97(第Ⅰ批)、2.11(第Ⅱ批)和2.25 mg/g(第Ⅲ批)；隨著生長時(shí)間延長，牛大力藥材總黃酮含量有較大增加。[結(jié)論]鹽酸鎂粉顯色測定操作簡便快速，顯色穩(wěn)定，具有較好的精密度、重現(xiàn)性，測定牛大力總黃酮含量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但也存在靈敏度低、對(duì)照品濃度高的缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞牛大力；總黃酮；鹽酸鎂粉法；跟蹤分析；經(jīng)濟(jì)林

牛大力，別名山蓮藕、大力薯等，為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millettia specisoaChamp.)的根，具有舒筋活絡(luò)、潤肺滋腎、清熱止咳等功效[1]，用于治療腰肌勞損、肺熱肺虛咳嗽、肺結(jié)核、慢性支氣管炎、肝炎等，主要分布在福建、廣西、廣東等地。牛大力作為一種藥食同源的植物，需求與日俱增，廣泛被藥企加工成眾多中成藥，并不斷開發(fā)新產(chǎn)品，提高其保健作用與產(chǎn)品附加值[2]。牛大力根中含多種黃酮化合物，已經(jīng)報(bào)道分離鑒定了13個(gè)黃酮類化合物，如異甘草素(4,2′,4′-三羥基查耳酮)、芒柄花素(7-羥基-3-(4-甲氧基苯基)色酮)、3,4,2′,4′-四羥基查爾酮、4′-羥基-7-甲氧基二氫黃酮、3′,7-二羥基-2′,4′-二甲氧基異黃酮等[3-7]。鑒于牛大力含有多種黃酮化合物會(huì)對(duì)其藥理、藥效作用產(chǎn)生重大影響，很有必要對(duì)其提取分離純化、含量測定以及相關(guān)的藥理作用和機(jī)制進(jìn)行深入研究[8-9]。目前，黃酮含量測定方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、毛細(xì)電泳法、超臨界流體色譜法以及薄層掃描法等[10-12]，分光光度法作為測量黃酮的經(jīng)典方法，操作簡單易行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在黃酮的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前僅王呈文等[8]報(bào)道了采用分光光度法及硝酸鋁鹽顯色測定牛大力的黃酮含量，筆者在此進(jìn)行了一定改進(jìn)，采用鹽酸鎂粉顯色法對(duì)處于生長期中的3批次采集于經(jīng)濟(jì)林下種植的牛大力藥材的總黃酮含量進(jìn)行測定，跟蹤分析其總黃酮含量的變化，為進(jìn)一步完善牛大力藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)、推廣林下種植牛大力等藥材提供理論參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥材。鮮牛大力藥材種植在防城港地區(qū)“經(jīng)濟(jì)林下種植藥材牛大力、巴戟天和黑老虎示范基地”，2012年秋冬種植，于2014年10月(第Ⅰ批)、2015年2月(第Ⅱ批)和6月(第Ⅲ批)分3批采摘，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)滕建北教授鑒定為美麗崖豆藤(Millettia specisoaChamp.)的根。

1.1.2主要儀器。電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；8453紫外可見分光光度計(jì)(美國安捷倫)；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ5200B超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；KQ-B玻璃儀器氣流烘干器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；HH-S恒溫水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司)；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.1.3主要試劑。蘆丁對(duì)照品(購于上海如吉生物科技)；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鎂粉等均為分析純，水為蒸餾水。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，75%的乙醇超聲溶解，定容至 10ml量瓶中即得濃度為1.0mg/ml，備用。

1.2.2供試品溶液的制備。取2014年10月、2015年2月、6月采集的3批次新鮮、干凈牛大力1.0kg，切片，烘箱80 ℃烘干，恒重稱量分別得到493.5、499.0、503.5g，分別粉碎成粗粉，精密稱取質(zhì)量各150g，按照m(牛大力，g)∶V(EtOH，ml)=1∶5，75%乙醇回流提取3次，第1次2h、第2次1.5h、第3次1h，濾過，合并濾液定容100ml即得，備用。

1.2.3最大吸收波長的確定。精密吸取對(duì)照品溶液3.0ml和樣品溶液 3.0ml，分別置于加有鎂粉300mg的具塞試管中，將試管置冷水浴(約15 ℃)中，緩慢滴加濃鹽酸3.0ml并不時(shí)振搖試管，加75%乙醇補(bǔ)足至10ml，搖勻，置沸水浴中加熱60min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，以吸光度為縱坐標(biāo)、吸收波長(nm)為橫坐標(biāo)，于400～700nm進(jìn)行紫外掃描，得到樣品溶液與對(duì)照品溶液的紫外吸收光譜，確定最大吸收波長。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取蘆丁1.0mg/ml對(duì)照品溶液0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5ml分別置于有鎂粉的具塞刻度管中，按步驟“1.2.3”的方法顯色，以試劑空白為參比溶液，在確定的最大吸收波長處測定其吸光度。以蘆丁取樣量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。取樣品溶液3.0ml置于有鎂粉的具塞刻度管中，按步驟“1.2.3”的方法顯色，每隔10min測定一次吸光度，共測7次，計(jì)算RSD值。

1.2.4.3精密度試驗(yàn)。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0mg/ml5份，每份3.0ml，置于有鎂粉的具塞刻度管中，按“1.2.3”的方法顯色，測定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)。取樣品溶液5份，每份3.0ml置于有鎂粉的具塞刻度管中，按步驟“1.2.3”的方法顯色，測定吸光度，計(jì)算RSD值。

1.2.4.5加樣回收試驗(yàn)。分別取3批樣品溶液各3.0ml，每批3份，置于有鎂粉的具塞刻度管中，分別加入稀釋為0.5mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5、1.0、1.5ml，按步驟“1.2.3”的方法顯色，測定吸光度，并計(jì)算RSD值。

2結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的確定由圖1可見，樣品和蘆丁對(duì)照品在533nm處有吸收，兩者的吸收波長較為接近，且峰形較為一致，使用此法測定牛大力總黃酮的含量較為理想。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按“1.2.4.1”方法操作，測得的吸光度分別是0.306 8、0.423 2、0.518 5、0.623 1、0.730 9、0.836 6。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，計(jì)算得線性回歸方程為y=0.525 2x +0.047 9(R2=0.999 6)，表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在0.5～1.8mg/ml濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.2”方法操作，結(jié)果表明(表1)，樣品溶液用鹽酸鎂粉顯色在測定時(shí)間1h內(nèi)比較穩(wěn)定，所以在試驗(yàn)操作過程中應(yīng)嚴(yán)格控制時(shí)間，應(yīng)在1h內(nèi)完成測定。

表1　鹽酸鎂粉法穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.3”方法操作，結(jié)果表明(表2)，5次測定的吸光度平均值為0.205 5，RSD值為1.02%，小于2%，可見此法精密度良好。

表2　鹽酸鎂粉法精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，結(jié)果表明(表3)，5次測定的吸光度平均值為0.649 6，RSD為1.48%，可見樣品溶液用此顯色方法測定重復(fù)性均良好。

表3　鹽酸鎂粉法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5加樣回收試驗(yàn)。加樣回收試驗(yàn)測得吸光度分別是0.527 2、0.637 7、0.767 7(第Ⅰ批)，0.534 3、0.647 4、0.777 9(第Ⅱ批)，0.532 3、0.648 7、0.789 5(第Ⅲ批)，3批的平均回收率分別為91.30%、92.69%、93.12%，RSD分別為1.02%、0.92%、1.27%(表4)。按照相關(guān)資料總黃酮的回收率應(yīng)在80%～120%，上述數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)回收率符合要求，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于牛大力藥材中總黃酮的含量測定；但標(biāo)準(zhǔn)品使用的濃度比較大，比較浪費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)品。

表4　鹽酸鎂粉法加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.3樣品含量測定由表5可見，不同的采摘時(shí)間，牛大力黃酮含量不同，且隨著生長時(shí)間延長，黃酮含量有所增加，幅度還比較大，這可能是藥材生長時(shí)間越長植物體內(nèi)積聚的黃酮類也越多的原因。

表5　鹽酸鎂粉顯色法測定黃酮含量(n = 2)

3結(jié)論與討論

該研究以蘆丁為對(duì)照品，采用鹽酸鎂粉比色法跟蹤測定3批次采集于林下種植示范基地處于生長期的牛大力黃酮含量，評(píng)價(jià)牛大力的質(zhì)量指標(biāo)，為進(jìn)一步推廣林下種植牛大力、巴戟天等藥材提供理論參考依據(jù)。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在最大吸收533nm波長下進(jìn)行測定，蘆丁在濃度0.5～1.8mg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率在91.30%～93.12%，RSD在0.92%～1.27%；3批次總黃酮含量分別為1.97(第Ⅰ批)、2.11(第Ⅱ批)和2.25mg/g(第Ⅲ批)；對(duì)鮮牛大力藥材進(jìn)行干燥后，隨著牛大力藥材的生長時(shí)間延長，得到的干藥材質(zhì)量增加，消除試驗(yàn)誤差后，這可能與植物生長的時(shí)間有關(guān)，時(shí)間越長，植物越老，成數(shù)也越高；鹽酸鎂粉比色法能夠快捷、簡便、準(zhǔn)確地測定牛大力的總黃酮含量，可作為牛大力黃酮指標(biāo)含量的常用測定方法，但蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品使用的濃度比較大，比較浪費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)品，這是該法不足的地方。

前期對(duì)硝酸鋁鹽顯色法進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)該法存在對(duì)照品與樣品最大吸收峰形和波長不一致的問題，可能會(huì)影響測定的結(jié)果。所以該研究進(jìn)行了改進(jìn)，采用了鹽酸鎂粉比色法進(jìn)行牛大力黃酮含量測定，效果良好。

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中圖分類號(hào)S567

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)30-044-03

基金項(xiàng)目廣西科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科重1298001-2-7)；廣西高?？萍紕?chuàng)新能力提升工程專項(xiàng)項(xiàng)目(70-ZJGX201401004)；2014年博士研究生教育發(fā)展項(xiàng)目(050140002)；校級(jí)重大課題(ZDA2012003)。

作者簡介鐘益寧(1967-)，男，廣西鐘山人，副教授，博士，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

收稿日期2015-09-16

TrackandAnalyseontheFlavonoidsContentfromMillettia specisoaChamp.PlantedinEconomicalWoodlands

ZHONGYi-ning,LIUHuan,WUShi-yunetal(GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning,Guangxi530299)

Abstract[Objective]The flavonoids content of Millettia speciosa Champ. was determined to analyze the content changed that planted in economical woodlands.[Method]Using rutin as the standard sample,three batch growing vigorously Millettia speciosa Champ herbs were collected and analyzed the change of flavonoids content with HCl-Mg colorimetry method.[Result]Under the maximum 533 nm absorption wavelength, rutin had a liner relationship with absorbance in the range of 0.5-1.8 mg/ml,the average recovery was 91.3%-93.12% with RSD of 0.92%-1.27%．The flavonoids content of Millettia speciosa Champ．were 1.97(Ⅰ batch), 2.11(Ⅱ batch),2.25 mg/g (Ⅲbatch).The flavonoids content increased considerably with growth period prolonged.[Conclusion] HCl-Mg colorimetry method was simple and easy, color stability, high sensitivity and little interference.The determination results of flavonoids content from Millettia speciosa Champ.were accurate and reliable.However, there were two faults of low sensitivity and higher reference substance concentration.

Key wordsMillettia specisoa Champ.;Flavonoids;HCl-Mg colorimetry method;Track and analyse;Economical woodlands