謝麗曲，曾麗莉，陳婉如，王長康，陳文忠，曾興有

(1.廈門惠盈動物科技有限公司，福建廈門361023;2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建福州350013;3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002;4.福建省華龍集團(tuán)飼料有限公司，福建福州350013)

抗生素在畜禽配合飼料應(yīng)用的過程中產(chǎn)生的病原抗藥性及后續(xù)的環(huán)境問題已成為共識，尋找抗生素替代品是飼料研究工作者迫在眉睫的任務(wù).益生菌是最具潛力的抗生素替代品之一，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacil-lus coagulans)作為益生菌的一種，屬于孢子性乳酸菌，具有保健效果好、抗逆性強(qiáng)、無殘留、無污染、在飼料加工過程中不易受損等優(yōu)點(diǎn)，引起人們的廣泛關(guān)注.凝結(jié)芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生維生素、氨基酸、促生長因子和短鏈脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)[1－2]，分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶[3－4]，降解果膠、葡聚糖和纖維素等復(fù)雜的碳水化合物[5]，還可促進(jìn)動物機(jī)體對某些礦物質(zhì)元素(如鐵、磷、鈣和鋅等)和VD的吸收利用[6－7].相關(guān)研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌對調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)抗性、提高畜禽生產(chǎn)性能有一定的作用[8－11]，但其應(yīng)用于肉鴨上的研究報(bào)道較少，作用機(jī)理研究不夠深入.本試驗(yàn)初步探討凝結(jié)芽孢桿菌飼喂肉鴨后的作用機(jī)理，為其在肉鴨配合飼料中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

凝結(jié)芽孢桿菌制劑(活菌含量為1×109cfu·g－1)由福建洛東生物技術(shù)有限公司提供;750羽1日齡櫻桃谷公鴨由福建漳州昌龍農(nóng)牧有限公司提供.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取750羽體質(zhì)健康、體重中等的1日齡櫻桃谷公鴨隨機(jī)分為5組，每組5個重復(fù)，每重復(fù)30羽.Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)飼糧;Ⅱ組在基礎(chǔ)飼糧中添加300 mg·kg－110%桿菌肽鋅;Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加100、200和300 mg·kg－1凝結(jié)芽孢桿菌制劑，試驗(yàn)期42 d.基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1.

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient level of basal diet(air-dry basis)

1.3 樣品采集與指標(biāo)檢測

1.3.1 取樣 分別于試驗(yàn)第1、21和42天上午8:00對每組5個重復(fù)進(jìn)行空腹稱重，并記錄每日供料量、剩余量、損耗量和鴨只死淘數(shù)，計(jì)算采食量、日增重、料重比和成活率.

分別于試驗(yàn)第21和42天對每組5個重復(fù)隨機(jī)抽取2羽體質(zhì)健康、體重中等的肉鴨用真空采血管翅靜脈采血10 mL，轉(zhuǎn)移到離心管中靜置3 min后，于3000 r·min－1離心10 min，分離血清，做好標(biāo)記，置－20℃保存，用于血清抗氧化指標(biāo)的測定.

對采血后的鴨只進(jìn)行屠宰(采血前稱活體重，稱重前空腹6 h)，摘取其胸腺、脾臟和法氏囊，用濾紙吸去其表面體液，用手術(shù)刀片剝離脂肪并稱重，測定免疫器官指數(shù).

剪取屠宰鴨只的十二指腸(長度約1 cm)于生理鹽水中輕輕振蕩，將內(nèi)容物沖洗干凈后，置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后用石蠟包埋，測定其絨毛高度和隱窩深度.

1.3.2 血清抗氧化指標(biāo)的測定 選用谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量作為血清抗氧化指標(biāo)，用紫外—可見分光光度計(jì)測定，試劑盒購自南京建成生物工程研究所.

1.3.3 免疫器官指數(shù)的測定 采用稱重法測定免疫器官指數(shù)，免疫器官(胸腺、脾臟和法氏囊)指數(shù)=免疫器官重(g)/活體重(kg).

1.3.4 十二指腸組織結(jié)構(gòu)的測定 將石蠟包埋好的樣品進(jìn)行切片，每張切片厚度5 μm，每10片取3片，每張切片選取3個視野，每個視野連續(xù)測定3根腸絨毛，用HPIAS-5100高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)作定量分析，測量其絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度(V/C).

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著后進(jìn)行LSD多重比較，以P＜0.01(差異極顯著)，P＜0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響

由表2可知:1－21日齡肉鴨，與Ⅰ組相比，Ⅳ和Ⅴ組的日增重分別提高0.39%(P＞0.05)和1.18%(P＞0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組的料重比與Ⅰ和Ⅱ組相比分別降低 1.25%(P＜0.05)、1.88%(P＜0.05)、2.5%(P＜0.05)和 0%(P＞0.05)、0.63%(P＞0.05)、1.27%(P＞0.05);各組間的日采食量和成活率差異不顯著(P＞0.05).

1－42 日齡肉鴨，Ⅳ和Ⅴ組的日增重比Ⅰ組分別提高 3.78%(P＜0.01)和 2.82%(P＜0.05);Ⅳ組的料重比與Ⅰ和Ⅱ組相比分別降低4.04%(P＜0.01)和2.25%(P＞0.05);各組間的日采食量和成活率差異不顯著(P＞0.05).

表2 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響1)Table 2 Effects of B.coagulans on growth performance in meat ducks

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知:21日齡肉鴨，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組血清的GSH-PX活性比Ⅰ和Ⅱ組分別提高1.96%(P＞0.05)、1.64%(P＞0.05)、6.53%(P＜0.05)和 0.89%(P＞0.05)、0.58%(P＞0.05)、5.42(P＞0.05);各組間血清的T-SOD活性和MDA含量差異不顯著(P＞0.05).

42 日齡肉鴨，Ⅳ組血清的 GSH-PX 活性比Ⅰ和Ⅱ組分別提高 26.14%(P＜0.05)和 27.41%(P＜0.05)，Ⅲ和Ⅴ組比Ⅰ組分別提高16.25%(P＞0.05)和17.07%(P＞0.05);各組間血清的T-SOD活性和MDA含量差異不顯著(P＞0.05).

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

由表4可知:21日齡肉鴨，Ⅴ組的胸腺指數(shù)比Ⅰ和Ⅲ組分別提高26.67%(P＜0.05)和26.02%(P＜0.05);Ⅴ組的法氏囊指數(shù)比Ⅰ和Ⅱ組均顯著提高6.37%(P＜0.05);各組間的脾臟指數(shù)差異不顯著(P＞0.05).

42 日齡肉鴨，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組的胸腺指數(shù)比Ⅰ組分別提高 15.67%(P＞0.05)、36.19%(P＜0.05)和27.24%(P＞0.05);Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組的脾臟指數(shù)比Ⅰ組分別提高 18.52%(P＞0.05)、11.11%(P＞0.05)、22.22%(P＞0.05)和 29.63%(P＜0.05);各組間的法氏囊指數(shù)差異不顯著(P＞0.05).

表3 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨血清抗氧化指標(biāo)的影響1)Table 3 Effects of B.coagulans on serum antioxidant index of meat ducks

表4 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響1)Table 4 Effects of B.coagulans on immune functions in meat ducks g·kg－1

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響

由表5可知:21日齡肉鴨，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組的十二指腸絨毛高度比Ⅰ組分別提高31.38%(P＜0.05)、31.11%(P＜0.05)、31.33%(P＜0.05)和 31.87%(P＜0.05)，其余各組間的差異不顯著(P＞0.05);與Ⅰ組相比，Ⅳ和Ⅴ組的 V/C 分別提高46.03%(P＜0.01)和 50.41%(P＜0.01);各組間的十二指腸隱窩深度差異不顯著(P＞0.05).

42日齡肉鴨，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組的十二指腸絨毛高度和V/C比Ⅰ組分別提高20.32%(P＜0.01)、20.52%(P＜0.01)、14.83%(P＜0.05)和 21.43%(P＜0.05)、32.01%(P＜0.01)、23.02%(P＜0.05)，與Ⅱ組的差異不顯著(P＞0.05);各組間的十二指腸隱窩深度差異不顯著(P＞0.05).

表5 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響1)Table 5 Effects of B.coagulans on organization structure of duodenum in meat ducks

3 討論

3.1 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨生長性能的影響

凝結(jié)芽孢桿菌作為孢子性乳酸菌，具有很好的保健促生長作用.施海濱等[8]研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌TBC169對預(yù)防抗生素相關(guān)性腹瀉有一定的作用.王文杰[9]研究表明，在生長肥育豬的日糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌可提高其日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，提高經(jīng)濟(jì)效益.吳建忠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加乳酸芽孢桿菌可顯著提高齊卡肉兔的日增重，降低料重比.Alex et al[11]研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌能提高肉用仔雞的飼料轉(zhuǎn)化率，增加空腸中的乳酸桿菌數(shù)，降低大腸桿菌類有害菌數(shù)，調(diào)節(jié)腸道微生物的菌群平衡.本試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜添加量的凝結(jié)芽孢桿菌能明顯促進(jìn)肉鴨生長，降低料重比.試驗(yàn)前期，添加量為300 mg·kg－1組的效果好于其他組，這可能是因?yàn)橛g肉鴨消化道發(fā)育不完全，腸道菌群結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，消化液分泌不足，外來有益菌可在腸道優(yōu)先定植并調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)平衡;試驗(yàn)全期，200 mg·kg－1組促生長效果最明顯.霍軍等[12]和李國建[13]研究表明，在生長育肥豬的飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可以顯著提高其日增重和飼料轉(zhuǎn)化率;付天璽等[14]研究表明，添加不同劑量的凝結(jié)芽孢桿菌均能顯著提高奧尼羅非魚胃、肝、胰臟和腸道的蛋白酶活性;王彥波[15]研究也表明，凝結(jié)芽孢桿菌可改善羅非魚的生長性能和肌肉中鈣、磷和粗脂肪的含量;Khaksefidi et al[16]也證明在肉仔雞飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌可以提高肉雞的采食量、促進(jìn)其生長.以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致.

3.2 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨血清抗氧化指標(biāo)的影響

櫻桃谷肉鴨體內(nèi)脂肪含量較高，易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且產(chǎn)物對機(jī)體有一定的損害作用.GSH-PX廣泛存在于機(jī)體內(nèi)，能特異催化過氧化氫和還原型谷胱甘肽發(fā)生反應(yīng)，具有清除體內(nèi)自由基和阻止脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的作用，從而能保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性.超氧化物歧化酶是一種含金屬離子的氧化還原酶，能清除體內(nèi)有毒氧自由基并防御其產(chǎn)生毒素[17]，其活性反映了機(jī)體對抗自由基損傷的能力.MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝終產(chǎn)物，其含量反映氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化程度，間接反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度.余東游等[18]研究表明，枯草芽孢桿菌能顯著提高肉雞血清中的GSH-PX和超氧化物歧化酶活性，并顯著降低MDA含量.董秀梅等[19]在肉仔雞的飲水中添加芽孢桿菌復(fù)合制劑也達(dá)到了同樣的效果.唐志剛等[20]在肉仔雞的日糧中添加益生菌也達(dá)到了提高血清抗氧化能力的目的.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在肉鴨配合飼料中添加一定量的凝結(jié)芽孢桿菌可以提高肉鴨血清中的GSH-PX活性.此結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果一致，說明凝結(jié)芽孢桿菌能促進(jìn)體內(nèi)自由基的清除，減弱脂質(zhì)過氧化程度，提高肉鴨血清的抗氧化功能.

3.3 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨免疫器官指數(shù)的影響

胸腺、法氏囊和脾臟是肉鴨重要的免疫器官.其中，胸腺是機(jī)體中樞免疫器官，參與細(xì)胞免疫;脾臟是機(jī)體最重要的外周免疫器官，參與全身體液和細(xì)胞免疫;法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官，參與體液免疫.本試驗(yàn)結(jié)果表明，在肉鴨飼糧中添加凝結(jié)芽孢桿菌組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)和法氏囊指數(shù)均比基礎(chǔ)飼糧組和抗生素對照組高.房志仲等[21]研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌TQ33菌株可增強(qiáng)小鼠NK細(xì)胞活性.王翮飛等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加益生素可提高肉仔雞的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù).孔令勇等[23]研究表明，微生態(tài)制劑能顯著提高櫻桃谷肉鴨的法氏囊指數(shù)，增強(qiáng)其免疫機(jī)能，與本試驗(yàn)結(jié)果一致.可見，在肉鴨配合飼料中添加一定量的凝結(jié)芽孢桿菌可提高肉鴨的免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)免疫力.

3.4 凝結(jié)芽孢桿菌對肉鴨十二指腸組織結(jié)構(gòu)的影響

小腸是機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場所，絨毛是腸道黏膜的特殊結(jié)構(gòu)，正常腸絨毛排列緊密整齊，形狀細(xì)長呈柱狀，當(dāng)機(jī)體受到應(yīng)激或微環(huán)境失調(diào)時，腸絨毛易受損，主要表現(xiàn)為絨毛粗短、歪斜或倒伏等[24].絨毛高度及完整性，決定了小腸吸收面積，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、利用和動物的生長發(fā)育.腸道隱窩深淺主要反映上皮細(xì)胞的生成率，隱窩變淺說明細(xì)胞成熟率提高.V/C綜合反映了小腸的功能狀況，比值降低，表明吸收功能下降，機(jī)體生長發(fā)育受限;比值升高，吸收功能增強(qiáng)，促進(jìn)動物的生長發(fā)育[25].劉傳虎等[26]研究表明，在早期斷奶仔豬的日糧中添加益生菌制劑可以顯著提高空腸和回腸絨毛高度及降低回腸隱窩深度.景翠等[27]也報(bào)道，將一定量的地衣芽孢桿菌添加至海蘭灰蛋雞的飼糧中，能夠提高雞十二指腸和空腸絨毛的高度，增加V/C.本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加凝結(jié)芽孢桿菌組的十二指腸絨毛高度及V/C均有所提高，且差異達(dá)到顯著或極顯著水平.可見，在肉鴨配合飼料中添加適量的凝結(jié)芽孢桿菌有增加腸道絨毛高度、提高V/C的作用，從而增加營養(yǎng)物質(zhì)與腸道接觸的面積，促進(jìn)消化吸收.

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