馮 瑩，賴鐘雄

(1.泉州師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，福建 泉州362000;2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002)

石斛蘭(Dendrobium species.)是蘭科石斛屬多年生植物，屬于“四大洋蘭”之一，除了具有藥用價(jià)值外，還具有較高的觀賞價(jià)值[1].自然條件下，石斛蘭分株能力弱，繁殖速度慢，不能滿足市場(chǎng)和消費(fèi)者的需求.1960年法國(guó)人Morel[2]利用莖尖組織培養(yǎng)無(wú)病毒植株，創(chuàng)立石斛無(wú)性繁殖技術(shù)，隨后，石斛蘭的研究備受關(guān)注[3－19，24－25]，馮瑩等[3]以石斛蘭原球莖為材料，利用外源激素和糖優(yōu)化原球莖的生長(zhǎng)，為石斛蘭遺傳轉(zhuǎn)化提供了良好的受體材料.以石斛蘭原球莖為受體材料采用甘露醇預(yù)處理提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[4]，并獲得轉(zhuǎn)化ACS反義基因的轉(zhuǎn)基因植株[5].目前，石斛蘭離體培養(yǎng)研究主要從以莖段或莖尖為材料建立再生體系[6－10]、成熟或未成熟種胚為材料建立再生體系[12，13]、壯苗生根優(yōu)化[14，15]、原球莖增殖優(yōu)化[3，16，17]等方面開(kāi)展，而以葉片外植體進(jìn)行石斛蘭離體再生體系建立的報(bào)道較少[18，19].此外，石斛蘭葉片再生體系建立為石斛蘭遺傳轉(zhuǎn)化、受體系統(tǒng)優(yōu)化等相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).本文以葉片為材料研究了石斛蘭離體再生途徑的建立，旨在解決葉片難誘導(dǎo)原球莖問(wèn)題和提高石斛蘭的再生能力，為保護(hù)瀕危植物資源和基因工程研究提供有效的參考價(jià)值.

1 材料與方法

1.1 材料

石斛蘭(Dendrobium spp.)葉片.

1.2 外植體消毒

將葉片置于流水中沖洗30 min，75%酒精浸30 s后，用0.1%升汞消毒8 min，最后用無(wú)菌水沖洗3次，獲得無(wú)菌外植體.

1.3 方法

1.3.1 原球莖誘導(dǎo) 分別將無(wú)菌葉片切割成 0.5 cm×(0.3－0.5)cm 小塊接種于 KC+6-BA(2.0、4.0、6.0 mg·L－1)+NAA(0.5、1.0 mg·L－1)培養(yǎng)基中，30 d 后統(tǒng)計(jì)原球莖的誘導(dǎo)率.各組合接種 5 瓶，每瓶接 5 片葉片切割的葉塊，各處理重復(fù)3次.

1.3.2 原球莖增殖與分化 以原球莖為材料，原球莖切割成0.2－0.5 mm3的小塊培養(yǎng)于不同培養(yǎng)基(表1)中.培養(yǎng)25 d后觀察原球莖生長(zhǎng)狀態(tài)并統(tǒng)計(jì)原球莖增殖倍數(shù)和分化率.各組合6瓶，每瓶接入35－40個(gè)原球莖，各處理重復(fù)3次.

表1 石斛蘭原球莖增殖與分化1)Table 1 Propogation and differentiation of PLBs in Dendrobium spp.

針對(duì)KC+2 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA培養(yǎng)基中添加不同天然附加物(液體椰子汁、椰乳勻漿物、香蕉勻漿物、蘋(píng)果勻漿物、馬鈴薯勻漿物、活性炭，其中除附加物活性炭的濃度為1.0 g·L－1外，其余濃度均為100.0 g·L－1)進(jìn)行試驗(yàn).各組合6瓶，每瓶接入35－40個(gè)原球莖，各處理重復(fù)3次.

1.3.3 壯苗和生根 以苗高為0.5 cm的石斛蘭無(wú)根小苗為材料，以1/2MS(大量元素減半，其余各元素不變，以下均同)為基本培養(yǎng)基，添加NAA、6-BA和添加物，按L9(34)(其中NAA為因素1，3水平分別為1.0、1.5、2.0 mg·L－1;6-BA 為因素 2，3 水平分別為 0.0、0.2、0.4 mg·L－1，天然附加物為因素 3，3 水平分別為無(wú)添加物、100.00 g·L－1香蕉勻漿物、1.0 g·L－1活性炭)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定適宜的壯苗生根培養(yǎng)基.每瓶接4株，各組合8瓶，各處理重復(fù)3次.培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)苗高和根數(shù)量及長(zhǎng)度，并觀察苗的生長(zhǎng)狀況.

1.3.4 移栽基質(zhì)的篩選 選取苗高約2.0 cm且長(zhǎng)勢(shì)一致的小苗為材料，以水草、松樹(shù)皮(移栽前將其碾成小塊后，用水充分浸泡，并每隔1 d換1次水)、棕樹(shù)皮(移栽前一段時(shí)間用水充分浸泡)、稻谷殼為移栽基質(zhì).移栽前將試管苗在自然條件下煉苗30 d后，洗去根部的培養(yǎng)基，用500 mg·L－1的多菌靈浸泡小苗5 min后，種植于不同移栽基質(zhì)中，置于大棚中培養(yǎng)，每種處理30株小苗，30 d后統(tǒng)計(jì)其成活率.

1.4 培養(yǎng)條件與數(shù)據(jù)分析

培養(yǎng)基中添加 20 g·L－1白糖、6 g·L－1瓊脂，pH 為 5.4，光照強(qiáng)度 1500 lx，光照時(shí)間 12 h·d－1，培養(yǎng)溫度25±1℃.

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出原球莖的葉片塊數(shù)/總塊數(shù)×100%;增殖倍數(shù)=(轉(zhuǎn)接瓶數(shù)－原有瓶數(shù))/原有瓶數(shù);分化率(%)=分化成苗的原球莖總數(shù)/總原球莖數(shù)量×100%.用DPS軟件分析數(shù)據(jù)，小寫(xiě)字母(a，b)表示差異顯著性檢測(cè)水平為0.05;大寫(xiě)字母(A，B)表示差異顯著性檢測(cè)水平為0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響

葉片切割成小塊后培養(yǎng)于培養(yǎng)基Ⅲ(KC+4.0 mg·L－16-BA+1.0 mg·L－1NAA)中誘導(dǎo)原球莖的效果好，其誘導(dǎo)率為11.99%，與其他組合呈極顯著性差異(圖1);原球莖主要是由葉片基部或葉尖部位誘導(dǎo)而來(lái)(圖2－A).6-BA濃度為4.0 mg·L－1時(shí)易誘導(dǎo)原球莖，其濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)均不利于原球莖誘導(dǎo);6.0 mg·L－16-BA培養(yǎng)時(shí)，葉片容易褐化死亡.

圖1 葉片對(duì)原球莖的誘導(dǎo)率Fig.1 Rate of induced protocorm from leaves

2.2 不同培養(yǎng)基種類對(duì)原球莖增殖和分化的影響

不同培養(yǎng)基種類對(duì)原球莖增殖和分化具有不同的影響，從表1中可以看出:石斛蘭原球莖在KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA培養(yǎng)基中增殖倍數(shù)較高，原球莖能不斷地自身繁殖，分化率低(圖2－B).而 1/2MS+0.5 mg·L－16-BA 培養(yǎng)基中原球莖增殖倍數(shù)是 KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA 培養(yǎng)基中的0.53倍，原球莖顆粒分化快(圖2－C).1/2MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的原球莖易分化，生長(zhǎng)較快;KC基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的原球莖分化慢，繁殖能力較好.因此，原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA，而分化培養(yǎng)基為 1/2MS+0.5 mg·L－16-BA.

圖2 石斛蘭的植株再生Fig.2 The regeneration of plantlets in Dendrobium spp.

2.3 不同添加物對(duì)原球莖增殖的影響

無(wú)附加物培養(yǎng)基中原球莖繁殖能力與其它附加物的呈顯著性差異(表2).不同添加物對(duì)原球莖增殖的影響不同，椰子汁和椰乳對(duì)原球莖的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯地不同，椰子汁培養(yǎng)基中原球莖增殖倍數(shù)是椰乳勻漿物的1.55倍，椰乳勻漿物培養(yǎng)基中原球莖易分化成苗;香蕉勻漿物培養(yǎng)基中原球莖生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)20 d開(kāi)始出現(xiàn)黃色菌;蘋(píng)果勻漿物培養(yǎng)基中原球莖表現(xiàn)出2種狀態(tài):1種為淺黃色，原球莖較大，表面有粉末狀的物質(zhì)形成，該物質(zhì)無(wú)生長(zhǎng)能力;2種為墨綠色，原球莖容易分化.馬鈴薯勻漿物培養(yǎng)基中原球莖易分化，且易生長(zhǎng)菌類物質(zhì).活性炭培養(yǎng)基中原球莖生長(zhǎng)緩慢，分化程度低.因此，采用無(wú)附加物的KC+2.0 mg·L－16-BA+0.5 mg·L－1NAA培養(yǎng)基適宜于原球莖的繁殖.

表2 天然附加物對(duì)石斛蘭增殖和生長(zhǎng)的影響1)Table 2 Effects of natural additives on propogation and growth of PLBs in Dendrobium spp.

2.4 不同培養(yǎng)基種類對(duì)石斛蘭壯苗生根的影響

根據(jù)表3可知，小苗在1/2MS+1.0 mg·L－1NAA培養(yǎng)基上苗高和根長(zhǎng)與其他組合達(dá)到極顯著性差異.經(jīng)正交方差分析表明:各因素影響生根的效果依次為天然附加物＞NAA＞6-BA;影響壯苗培養(yǎng)的效果依次為 6-BA＞NAA＞天然附加物.NAA 濃度為 1.0 mg·L－1時(shí)對(duì)生根培養(yǎng)的效果最好，優(yōu)于 1.5 mg·L－1和 2.0 mg·L－1.6-BA不同濃度水平對(duì)壯苗及生根均無(wú)顯著性差異.

表3 培養(yǎng)基對(duì)石斛蘭壯苗生根的影響1)Table 3 Effects of different media on the growth of roots in Dendrobium spp.

無(wú)根的小苗在1/2MS+1.0 mg·L－1NAA培養(yǎng)基中不僅高、粗壯，而且根系發(fā)達(dá)(表4，圖2－D)，植物長(zhǎng)勢(shì)很好(圖2－E).不同附加物對(duì)石斛苗生根的效果影響效果依次為無(wú)附加物＞香蕉＞活性炭，香蕉勻漿物培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)勢(shì)好，根較粗壯，但根系不發(fā)達(dá)，培養(yǎng)20 d后易出現(xiàn)黃色菌，苗生長(zhǎng)緩慢，甚至逐漸枯萎死亡.活性炭培養(yǎng)基中苗長(zhǎng)勢(shì)一般，根生長(zhǎng)勢(shì)差，部分為乳白色，生活力較差，甚至有10%苗在培養(yǎng)90 d后仍然沒(méi)有著生根.

表4 培養(yǎng)基對(duì)石斛蘭小苗生長(zhǎng)的影響1)Table 4 Effects of different media on the growth of plantlets in Dendrobium spp.

2.5 移栽基質(zhì)對(duì)石斛蘭移栽成活的影響

石斛蘭經(jīng)過(guò)煉苗移栽于各種基質(zhì)的成活率和生長(zhǎng)勢(shì)圖3中分析:在大棚內(nèi)移栽石斛蘭試管苗時(shí)，最好的移栽基質(zhì)為棕樹(shù)皮，成活率達(dá)到93.33%，苗長(zhǎng)勢(shì)好，生長(zhǎng)快(圖2－F).稻谷殼移栽基質(zhì)中苗成活率低，長(zhǎng)勢(shì)差，移栽后13 d苗開(kāi)始出現(xiàn)較為嚴(yán)重的腐爛現(xiàn)象.松樹(shù)皮移栽基質(zhì)中苗生長(zhǎng)較為緩慢，而水草移栽基質(zhì)中苗的生長(zhǎng)較快.

3 討論

圖3 移栽基質(zhì)對(duì)石斛蘭移栽成活率的影響Fig.3 Effects of different transferring media on the survival rate of Dendrobium spp.

葉片作為外植體是比較理想的材料來(lái)源，取材不受季節(jié)限制而且數(shù)量多.本研究以石斛蘭葉片為材料誘導(dǎo)原球莖，其誘導(dǎo)率為11.99%.這可能是由于成熟幼葉對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)極弱，這與王懷宇[20]的報(bào)道一致.如何有效地提高葉片外植體的原球莖誘導(dǎo)率有待于進(jìn)一步研究.

基本培養(yǎng)基的選擇是高效石斛蘭離體培養(yǎng)的基礎(chǔ).研究中發(fā)現(xiàn)KC基本培養(yǎng)基適宜于石斛蘭葉片原球莖誘導(dǎo)及其繁殖，而1/2MS基本培養(yǎng)基適宜于原球莖分化和壯苗生根培養(yǎng).這可能是由于1/2MS、KC基本培養(yǎng)基中均含有和，植物生長(zhǎng)時(shí)所需要的N源由供給，活性幾乎完全受到抑制[21]，1/2MS基本培養(yǎng)基中含量比KC基本培養(yǎng)基高，高濃度的能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[22].

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)石斛蘭原球莖誘導(dǎo)和繁殖、苗分化和生長(zhǎng)均有影響.6-BA低濃度有利于原球莖分化，高濃度對(duì)成苗起著抑制的作用.這與馮瑩[3]、王國(guó)梅等[16]的研究報(bào)道一致.NAA有利于提高原球莖誘導(dǎo)率和苗生根.本研究中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用NAA對(duì)生根效果優(yōu)于6-BA和NAA配合使用.這可能是由于6-BA、NAA分別屬于細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素類，體現(xiàn)2類激素對(duì)植物生長(zhǎng)的生理作用.適宜濃度的激素促進(jìn)細(xì)胞分裂，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(無(wú)機(jī)鹽、糖、水等)的吸收，或激素被吸收后，作為信使，與激素受體結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)[23]，進(jìn)而引起一系列生理生化反應(yīng)，啟動(dòng)基部細(xì)胞的生長(zhǎng)，促使細(xì)胞不斷分生.

天然附加物對(duì)石斛蘭原球莖和苗的生長(zhǎng)具有一定影響.天然附加物不利于原球莖和苗生長(zhǎng)，這可能是由于天然附加物中含有糖，提高培養(yǎng)基的滲透壓，影響其對(duì)生長(zhǎng)物質(zhì)的吸收.香蕉、馬鈴薯、蘋(píng)果勻漿物不利于原球莖生長(zhǎng)，與蔣林等[17]的報(bào)道一致.這可能由于勻漿物含有大量糖類物質(zhì)或抑制原球莖生長(zhǎng)的有機(jī)物質(zhì).這與李璐等[15]的報(bào)道不一致，可能是由于香蕉勻漿物使用的方式及其濃度不同.李小軍等[24]指出香蕉上清夜有利原球莖生長(zhǎng)，而沉淀物抑制其生長(zhǎng).活性炭不利于原球莖生長(zhǎng)，與Nihar et al[25]的報(bào)道一致.這可能是由于活性炭具有吸附作用，吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也將培養(yǎng)基中能夠促進(jìn)石斛蘭小苗生長(zhǎng)的有用成分吸附，造成原球莖和苗生長(zhǎng)緩慢.

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