黃代紅， 張振國(guó)， 陳國(guó)平， 李后魂， 石福臣

（南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071）

大戟科（Phyllanthaceae）葉下珠族（Phyllantheae）大部分植物都必須依賴種特異性傳粉（雌性）頭細(xì)蛾（Epicephala）專門為其傳粉，并且在雌花內(nèi)產(chǎn)卵，雙方形成專性傳粉互利共生關(guān)系［1-5］。花氣味在此關(guān)系中起著關(guān)鍵作用：可介導(dǎo)傳粉者找到宿主植物，促使兩者相遇［6］。目前關(guān)于大戟科植物-頭細(xì)蛾互利共生體系中花氣味方面的報(bào)道較少，僅限于算盤子屬少數(shù)植物以及黑面神屬植物小葉黑面神中［7，8］。

花氣味是由植物花器官釋放的一類低相對(duì)分子質(zhì)量、低沸點(diǎn)、低極性以及具有揮發(fā)性的次生代謝物質(zhì)［9］。在以往測(cè)定揮發(fā)物的研究中，通常采用傳統(tǒng)的收集方法，如溶劑抽提和水蒸氣蒸餾提取法［10］。這些技術(shù)操作存在對(duì)植物樣品的機(jī)械損傷及溫度變化，導(dǎo)致?lián)]發(fā)物的提取液中包含了大量不揮發(fā)性物質(zhì)，影響其真實(shí)性。因此，所獲得的提取物很難代表植物在正常生理狀態(tài)下的揮發(fā)物組成［11］。目前，揮發(fā)物收集的方法主要采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法（dynamic headspace adsorption），它因具備活體植株取樣、操作便捷、對(duì)色譜柱的傷害較小等優(yōu)點(diǎn)［12］，不僅被廣泛應(yīng)用 于 植 物 花 氣 味 的 收 集［13］，如 榕 樹［14-16］、百合［17］、桂花［18］以及木蘭［19］等，而且也常用來收集其他物質(zhì)中的揮發(fā)物，如小麥中的風(fēng)味物質(zhì)［20］、人工牛黃中的殘留溶劑［21］以及保健食品中的揮發(fā)物［22］等。

算盤子（Glochidion puberum）隸屬于大戟科（Phyllanthaceae）算 盤 子 屬（Glochidion），直 立 灌木，生于海拔300 ～2 200 米山坡、溪旁灌木叢或林緣。花期4 ～8 月，果期7 ～11 月，在我國(guó)主要分布于南方省區(qū)［23］。目前主要集中于算盤子與頭細(xì)蛾專性互利共生關(guān)系方面的研究［24］，至今還未見算盤子花氣味成分分析的報(bào)道。本研究采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集算盤子花氣味，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析其化學(xué)成分，為算盤子-傳粉頭細(xì)蛾互利共生關(guān)系的化學(xué)生態(tài)學(xué)方面的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HP6890 （GC）-5975 （MS）型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；聚氟乙烯采集袋（2 L，Teflon?FEP），大連德霖氣體包裝有限公司；微型空氣泵（FAY4002，6 L），成都?xì)夂C(jī)電制造有限公司；活性炭管（外徑6 mm，長(zhǎng)75 mm），Tenax TA 吸附管（100 mg／50 mg，60／80 目；外徑6 mm，長(zhǎng)75 mm），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)（LZB-4），天津流量?jī)x表有限公司；無(wú)味特氟隆管（PTEE），瑞典VICI Jour 公司；棕色進(jìn)樣瓶（2 mL），美國(guó)Agilent 公司；正己烷，色譜純，美國(guó)Fisher 公司；丙酮，優(yōu)級(jí)純，天津試劑公司。

1.2 材料

本研究頂空樣品野外收集于2013 年5 月上旬，供試植株為中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所百草園內(nèi)栽培的算盤子，采集盛花期的雌花和雄花各約200 朵。

1.3 算盤子花氣味收集

采用動(dòng)態(tài)頂空吸附法收集算盤子花氣味［25］，主要工作流程為：將采集好的花放入無(wú)味透明的聚氟乙烯采集袋中。首先，將通氣泵產(chǎn)生的空氣經(jīng)過活性炭管凈化，主要目的是除掉空氣中的水分以及灰塵，以免影響后續(xù)吸附劑對(duì)花氣味揮發(fā)物的吸附效果，由采集袋進(jìn)氣口通入袋內(nèi)，模擬自然狀態(tài)花氣味揮發(fā)；然后，用抽氣泵將花揮發(fā)的氣味經(jīng)由采集袋出氣口導(dǎo)入填充有Tenax TA 吸附劑的玻璃管中，進(jìn)行吸附收集。通氣端和進(jìn)氣端空氣流速均由玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)調(diào)節(jié)控制，為400 mL／min。收集裝置中所有器件均用無(wú)味的特氟隆管連接。采樣時(shí)間：晚上6 ∶30 ～11 ∶30，收集5 h。用空氣作為對(duì)照，與花氣味采集同步進(jìn)行。

采集完畢后，用保鮮膜密封吸附管，然后用錫箔紙包裹并裝入自封袋，置于超低溫冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。用2 mL 正己烷洗脫吸附管，收集0.5 mL 含有花氣味的洗脫液于2 mL 棕色進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)。氮吹濃縮至100 μL。最后將樣品置于-18 ℃冰箱保存，直至進(jìn)行儀器分析時(shí)取出。

1.4 氣相色譜條件

在Okamoto 等研究［7］的基礎(chǔ)上對(duì)氣相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。色譜柱：HP-5MS 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent，美國(guó)）；程序升溫：40 ℃保持5 min，之后以3 ℃／min 升溫至100 ℃，最后以5 ℃／min 升至200 ℃，保持5 min；進(jìn)樣量2 μL，采用分流模式，分流比2 ∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純He，流速1.0 mL／min。

1.5 質(zhì)譜條件

電離方式EI；質(zhì)量掃描范圍m／z 35 ～450；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.6 花氣味化合物定性與半定量

花氣味化學(xué)成分的鑒定首先利用儀器自帶的標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（NIST08）進(jìn)行檢索，對(duì)于譜庫(kù)檢索結(jié)果物質(zhì)單一，且匹配度高的峰，直接根據(jù)檢索結(jié)果給予確認(rèn)；然而，對(duì)于一些檢索結(jié)果中出現(xiàn)兩種及以上物質(zhì)的峰，進(jìn)一步在NIST 化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站（http：／／webbook. nist. gov／chemistry）上查詢這些物質(zhì)的保留指數(shù)，根據(jù)保留指數(shù)大小，最后加以確定。運(yùn)用離子流峰面積歸一化法計(jì)算花氣味各揮發(fā)物組分的相對(duì)含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。利用單因素方差分析中的Tukey’s 方法檢驗(yàn)花氣味不同類型揮發(fā)物相對(duì)含量之間的差異性。數(shù)據(jù)分析和圖片制作均用Graphad Prism 5. 0 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 算盤子花氣味動(dòng)態(tài)頂空吸附-GC-MS 總離子流圖

花氣味是植物長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，在傳粉過程中起到了吸引傳粉者的關(guān)鍵作用［26］。目前，動(dòng)態(tài)頂空吸附-GC-MS 技術(shù)廣泛應(yīng)用在植物與昆蟲的關(guān)系研究中，運(yùn)用此技術(shù)已分析鑒定出了小葉黑面神［8］、雞嗉子榕［14］花氣味的化學(xué)成分，并且通過電生理以及昆蟲行為學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選出了吸引各自傳粉者的化合物：小葉黑面神花中2-苯乙醇和2-苯乙腈，即具有電生理活性，而且兩者混合物也能夠吸引傳粉頭細(xì)蛾［8］；雞嗉子榕果揮發(fā)物中對(duì)苯甲基醚可以強(qiáng)烈地吸引榕小蜂［14］。因此，這種方法可信度高，收集的揮發(fā)物中包含了植物花真實(shí)的化學(xué)信息，可以為后續(xù)開展昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)提供可信的數(shù)據(jù)。本研究也采用動(dòng)態(tài)頂空吸附-GC-MS 對(duì)算盤子花氣味成分進(jìn)行分析，獲得其總離子流圖（見圖1），扣除空氣中雜質(zhì)峰后，共分離得到47 個(gè)峰，可以認(rèn)為此47 個(gè)峰幾乎代表了自然狀態(tài)下算盤子花揮發(fā)的全部揮發(fā)物。

圖1 算盤子花氣味的動(dòng)態(tài)頂空吸附-GC-MS 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of the floral scent components in G. puberum using gas chromatography-mass spectrometry with dynamic headspace

2.2 算盤子花氣味成分的GC-MS 分析

采用儀器自帶譜庫(kù)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)檢索，結(jié)合人工解析各個(gè)峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖，從算盤子花氣味中共鑒定出45 種化合物（見表1），相對(duì)含量超過1% 的只有11 種，占總含量的92.33%，分別是：順-丁酸-3-己烯酯、反-β-羅勒烯、反-氧化芳樟醇（呋喃型）、芳樟醇、β-欖香烯、γ-芹子烯、大根香葉烯D、β-芹子烯、α-芹子烯、β-人參烯和苯乙腈。在這45 種揮發(fā)物中，有超過40 種的化合物廣泛存在于其他一些植物花中［27］。因此，與同科植物小葉黑面神以及其他5 種算盤子植物一樣［7，8］，算盤子花氣味的化學(xué)組成也是通過常見的化合物來體現(xiàn)的。

表1 運(yùn)用GC-MS 分析算盤子花氣味成分的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of the floral scent components of G. puberum using gas chromatography-mass spectrometry

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

芳樟醇（38.06±3.36）% 和β-欖香烯（23.84±0.07）%兩種物質(zhì)在算盤子花氣味中含量最高，總共占相對(duì)含量的61.9% （見表1），是算盤子花氣味的主要成分，與已報(bào)道的5 種算盤子植物相比，它們的花氣味主要成分之間存在明顯的差異［7］。小葉黑面神花中2-苯乙醇和2-苯乙腈含量最高，超過80%，昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，這兩種物質(zhì)具有很強(qiáng)的電生理活性，兩者混合物能夠強(qiáng)烈吸引小葉黑面神頭細(xì)蛾［8］；因此，推測(cè)芳樟醇和β-欖香烯兩種含量很高的揮發(fā)物也可能是吸引算盤子頭細(xì)蛾的活性物質(zhì)。對(duì)于此推測(cè)還需要進(jìn)一步進(jìn)行頭細(xì)蛾電生理以及昆蟲行為學(xué)試驗(yàn)來驗(yàn)證。

2.3 算盤子花氣味中不同類型揮發(fā)物的比較

目前，通過現(xiàn)代提取技術(shù)從1 000 種植物花中已分離到1 720 種揮發(fā)性有機(jī)化合物［27］。通常分為3 大類：（1）脂肪族衍生物，通過脂肪酸途徑合成；（2）單萜和倍半萜類化合物，主要通過異戊二烯途徑合成；（3）苯環(huán)類芳香族化合物，通過莽草酸途徑合成［28］。在算盤子花氣味中，單萜類和倍半萜類物質(zhì)相對(duì)含量最高，分別為（44.6±2.06）% 和（49.6±2.46）%，顯著高于脂肪族衍生物（2.71±0.45）%和芳香族化合物（2.91±0.06）%。

大戟科葉下珠族算盤子屬、黑面神屬植物與頭細(xì)蛾之間都存在專性傳粉育幼互利共生關(guān)系［2-5］。同本研究一樣，Okamoto 等［7］發(fā)現(xiàn)另外5 種算盤子屬植物花氣味也主要以萜類物質(zhì)為主，尤其是單萜類物質(zhì)。然而，Svensson 等［8］研究表明小葉黑面神花氣味中芳香族化合物相對(duì)含量最高［7］。盡管與傳粉頭細(xì)蛾相關(guān)的葉下珠族植物種類繁多，但現(xiàn)已分析鑒定出花氣味成分的植物種類有限，就目前研究結(jié)果的對(duì)比分析可以看出，與頭細(xì)蛾相關(guān)的葉下珠族不同屬間植物花氣味化合物類別組成存在明顯的差異，主要原因可能是黑面神屬和算盤子屬植物在葉下珠族植物發(fā)育系統(tǒng)中分別屬于不同的獨(dú)立的進(jìn)化枝系［29］，導(dǎo)致它們的花氣味在進(jìn)化過程中同樣分化出屬于本屬特定的、區(qū)別于其他屬的化合物類別，同時(shí)也推測(cè)此類特定的化合物包含了其專門與種特異性傳粉頭細(xì)蛾進(jìn)行化學(xué)交流的主要物質(zhì)。

3 結(jié)論

采用動(dòng)態(tài)頂空-GC-MS 技術(shù)分析算盤子花氣味化學(xué)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芳樟醇（38.06%）和β-欖香烯（23.84%）這兩種物質(zhì)含量最高，推測(cè)可能是吸引傳粉頭細(xì)蛾的重要?dú)馕冻煞帧１狙芯繛檫M(jìn)一步開展觸角電生理檢測(cè)和生物行為試驗(yàn)來篩選吸引傳粉頭細(xì)蛾的活性物質(zhì)提供了理論依據(jù)。

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