林 黎， 張 毅 ， 涂小珂， 謝麗琪， 岳振峰， 康海寧， 吳衛(wèi)東， 羅 耀

（深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術(shù)中心，深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳518045）

喹諾酮類藥物（quinolones，QNs）是一類合成抗菌藥物，對革蘭氏桿菌和其他耐藥抗生素的細菌具有良好的抗菌作用，具有抗菌譜廣、吸收好、給藥方便、價格低廉等特點，在臨床治療感染方面有較廣泛應(yīng)用［1-4］。但當(dāng)喹諾酮類化合物違規(guī)添加到化妝品中，散布于人體皮膚表面，尤其是臉部、口唇等皮膚比較柔嫩，黏膜血管豐富的部位表面，則可能通過微血管和黏膜被快速吸收，逐漸破壞皮膚表面的正常菌群，導(dǎo)致皮疹、速發(fā)性過敏等不良反應(yīng)。因此喹諾酮類藥物在我國的化妝品衛(wèi)生規(guī)范中屬于嚴禁添加的藥物［5］。但是受到見效快、成本低的利益驅(qū)使，在祛痘、除螨、抗粉刺的化妝品中違禁添加喹諾酮類藥物的案例仍不時出現(xiàn)，有些不法廠商甚至采取添加少量多種的辦法逃避監(jiān)管。隨著人們生活水平的日益提高，化妝品已成為必不可少的消費品之一，其安全性已成為廣大消費者日益關(guān)注的問題。因此建立一個針對化妝品中多種類喹諾酮類藥物同時檢測的方法十分必要。

目前，國內(nèi)外對食品中喹諾酮類藥物殘留的檢測研究較多，也較為成熟。檢測方法多為高效液相色譜法［6，7］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8-19］、酶聯(lián)免疫法［20］等，對于化妝品中喹諾酮類藥物的分析研究較少，有的僅關(guān)注其中幾種喹諾酮類藥物［21，22］，難以適應(yīng)化妝品安全監(jiān)管的需要?；瘖y品根據(jù)用途和功效不同，基質(zhì)差異也較大，其主要成分有植物油脂、動物油脂、脂肪醇類、粉質(zhì)原料、表面活性劑和防腐劑等，若違禁添加抗生素，則添加含量通常在萬分之一到百萬分之一范圍。檢測化妝品中多種喹諾酮類藥物，不僅要求樣品提取和凈化方法要具有普適性和高效性，還要求檢測方法具有良好的選擇性和靈敏度。

本文建立了以溶劑提取、正己烷除脂結(jié)合液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-MS／MS）同時檢測水、乳、霜類化妝品中25 種喹諾酮類藥物的分析方法。方法的前處理過程有機溶劑用量少、處理通量大，能有效去除樣品中油脂、表面活性劑和粉類雜質(zhì)的干擾，其分離效果、選擇性和重現(xiàn)性均良好，各項性能指標滿足殘留檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器試劑

API 5000 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB 公司），配有電噴霧離子源；氮吹濃縮儀（美國ZYMARK 公司）；低溫離心機（德國Sigma 公司）；超聲波水浴機（德國Elmasonic 公司）；渦旋混合器（中國MS2 Minishaker）；Poroshell C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國Agilent 公司）。

喹諾酮類標準品：純度均大于98% （德國Dr.Ehrenstorfer 公司或者Fluka 公司提供）。正己烷、乙腈、甲醇、甲酸、乙酸（HPLC 級，德國默克公司）；氯化鈉（分析純，含量≥99.5%，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；乙腈溶液（含0.2% 甲酸）；0.1% 甲酸水溶液；乙腈-0.1% 甲酸水溶液（1 ∶9，體積比）；微孔濾膜（0.22 μm，有機相型）；水為二次蒸餾水。

樣品：水、乳液、霜類化妝品樣本均購于本地商場。樣品使用前混合均勻。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量標準品，以甲醇稀釋、定容。對難溶于甲醇的標準品，先加少量甲酸溶解，再以甲醇定容。標準儲備溶液于-30 ℃冰箱中保存。準確移取各個化合物的儲備液于容量瓶中，用甲醇稀釋配制成混合標準溶液，于-30 ℃避光保存?；|(zhì)匹配工作曲線以基質(zhì)空白提取液稀釋混合標準溶液，配制成不同濃度的混合標準工作液。

1.3 樣品前處理

乳液和霜類樣品：稱取1.0 g 樣品（精確至0.01 g）置于50 mL 具塞離心管中，加入2 g 氯化鈉和10 mL 0.2%甲酸的乙腈溶液，高速旋渦振蕩3 min，常溫超聲分散15 min，以9 500 r／min 離心5 min，取全部上清液移至另一離心管。剩余殘渣再準確加入10 mL 0.2%甲酸的乙腈，重復(fù)提取一次后合并上清液，旋渦混勻。準確吸取1 mL 上述提取液，40 ℃氮吹近干，用乙腈-0.1% 甲酸溶液（1 ∶9，體積比）定容至5 mL，再加入5 mL 正己烷溶液，混勻，9 500 r／min 離心5 min，棄去上層正己烷，將下層提取液以有機濾膜過濾，濾液供LC-ESI-MS／MS 測定。

水類樣品：稱取1.0 g 均勻樣品，置于50 mL 具塞離心管中，加入8 mL 含0.2% 甲酸的乙腈溶液，渦旋振蕩，超聲提取15 min，9 500 r／min 離心5 min，取上清液。殘渣再加入8 mL 含0.2% 甲酸的乙腈，重復(fù)上述提取過程一次，9 500 r／min 離心5 min 后合并上清液，用含0.2% 甲酸的乙腈定容至20 mL，混勻。準確吸取1 mL 上述提取液，40 ℃氮吹近干，用乙腈-0.1% 甲酸溶液定容至5 mL，過0.22 μm 有機濾膜，濾液供LC-ESI-MS／MS 測定。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜條件 Poroshell C18色譜柱；流動相A 為含0.1%甲酸的水，B 為含0.1% 甲酸的乙腈；梯度洗脫程序：0 ～6 min，87% A ～10% A；6 ～9 min，10% A；9 ～9.1 min，10%A ～87%A；9.1 ～15 min，87% A。流速：250 μL／min。柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。

質(zhì)譜條件 正離子電噴霧離子化（ESI＋），單位分辨率，噴霧電壓為4 500 V，碰撞氣為氮氣，碰撞氣壓力為41.4 kPa，氣簾氣壓力為448.3 kPa，霧化氣壓力為448.5 kPa，去溶劑氣壓力為276 kPa，離子源溫度為450 ℃。各化合物的監(jiān)測離子對（Q1／Q3）、去簇電壓（DP）、碰撞能（CE）以及碰撞室出口電壓（CXP）等質(zhì)譜參數(shù)見表1，在各個化合物保留時間前后各90 s 采集該化合物的兩個離子通道信號。

表1 25 種喹諾酮類藥物的主要質(zhì)譜參數(shù)和保留時間Table 1 MS parameters and retention times for the analysis of the 25 quinolones

表1 （續(xù)）Table 1 （Continued）

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

圖1 提取溶劑對25 種喹諾酮類藥物回收率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on recoveries of the 25 quinolones

已有研究報道主要以動物源樣品中喹諾酮類藥物殘留為主，較少涉及化妝品中該類藥物的檢測［14，15］。化妝品中喹諾酮類藥物分析有以下特殊性：一方面，化妝品中含有大量油脂、糖、表面活性劑，違規(guī)添加喹諾酮類藥物的含量通常在百萬分之一至萬分之一，因此要求前處理方法提取率要高、共萃取物盡可能少；另一方面，喹諾酮分子結(jié)構(gòu)中既有羧基又有氨基官能團，即具有兩性化合物的特性，對提取溶劑和方法具有較高要求［16，17］。實驗比較了乙腈、甲醇、二氯甲烷、甲醇＋沉淀劑（乙酸鋅＋亞鐵氰化鉀）等作為提取溶液的提取效果。結(jié)果如圖1所示，甲醇對于大部分喹諾酮類藥物的提取回收率為45% ～85%，對蛋白質(zhì)沉淀效果不佳且共萃取物較多；二氯甲烷提取出現(xiàn)了乳化現(xiàn)象；甲醇＋沉淀劑盡管去除蛋白效果較好，但部分藥物的提取回收率低于60%。乙腈沉淀蛋白效果最好，25 種喹諾酮類藥物回收率為75% ～115%，因此選擇乙腈為樣品提取溶劑。根據(jù)喹諾酮類藥物的酸堿性特點，實驗還比較了乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈和0.2%乙酸乙腈的提取結(jié)果，結(jié)果表明酸性乙腈對大部分喹諾酮類藥物的提取效果較好，加入甲酸或乙酸沒有明顯的差異，為了離子化環(huán)境盡量與流動相一致，選擇0.2%甲酸乙腈作為后續(xù)實驗的提取溶劑。

2.2 提取凈化方法的優(yōu)化

實驗對比了超聲水浴、渦旋振蕩和水平振蕩提取水、乳和霜類樣品的效果。乳液或霜類化妝品的黏度較大，超聲的空化作用使得樣品更易于均勻分散，提取效果優(yōu)于水平或渦旋振蕩提取的效果，回收率較滿意。在樣品凈化部分，曾嘗試將乙腈提取液濃縮后重新以緩沖溶液溶解，HLB 固相萃取小柱凈化，所得喹諾酮類藥物的回收率為30% ～70%，其原因可能是部分化合物在固定相上保留不佳。實驗改為無需固相萃取柱，而先以氮吹濃縮提取液，再以正己烷萃取進而除去脂溶性雜質(zhì)，所有目標物的回收率為71% ～117%，滿足檢測需求。

2.3 樣品基質(zhì)效應(yīng)

化妝品基質(zhì)比較復(fù)雜，分析物共流出組分直接影響電噴霧離子化效果與檢測信號的增強或抑制。為消除基質(zhì)效應(yīng)對目標化合物測定的影響，以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋液，用于對目標化合物進行定性和定量分析，這樣方法采用的標準溶液和樣品溶液都具有相似的離子化環(huán)境，從而確保方法的靈敏度和重現(xiàn)性。

2.4 質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化

首先采用50 μg／L 的喹諾酮混合標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，確定分子離子，然后分別以分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為定性離子。以多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式優(yōu)化25 種化合物的質(zhì)譜參數(shù)，具體如表1 所示。

2.5 線性關(guān)系、回收率、精密度和定量限

以峰面積為縱坐標y，各化合物的含量為橫坐標x，建立標準曲線，3 種化妝品基質(zhì)中25 種喹諾酮類化合物的線性關(guān)系均良好，其中保濕水樣品基質(zhì)中25 種喹諾酮類化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)見表2，線性范圍為1 ～200 mg／kg。采用標準添加法，選擇水、乳液、霜類化妝品空白樣品，分別添加1、5、10 mg／kg 3 個水平的喹諾酮混合標準溶液，每個加標水平平行測定6 次，回收率及精密度數(shù)據(jù)見表2，平均回收率范圍為87.4% ～105%，方法的相對標準偏差為4.54% ～19.7%。本方法的定量限為1.0 mg／kg。由MRM 譜圖（圖略）可以看出，所有目標化合物的色譜峰峰形對稱、無明顯干擾峰、檢測靈敏度好。

表2 樣品中25 種喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度（n＝6）Table 2 Linear equations，correlation coefficients （r），recoveries and precisions （RSDs）for the 25 quinolones spiked in sample （n＝6）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

3 結(jié)論

本研究測定的分析物為國內(nèi)外普遍禁止在化妝品中添加的抗生素喹諾酮類藥物，不僅要求分析方法能同時測定數(shù)十種喹諾酮類藥物，同時需要具有良好的靈敏度和準確性。本文以酸化乙腈提取、正己烷凈化，結(jié)合液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立了化妝品中25 種喹諾酮類藥物的分析方法。實驗優(yōu)化了影響回收率和重現(xiàn)性的主要因素，所建立的方法快速、簡便、重現(xiàn)性好、結(jié)果準確。該方法為化妝品中喹諾酮類禁用藥物的監(jiān)控和管理提供了高效、可靠的技術(shù)支持。

［1］ Zhao S J，Li C，Jiang H Y，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （趙思俊，李存，江海洋，等. 分析化學(xué)），2007，35（6）：786

［2］ Li P P，Guo Y M，Chen X C，et al. Food Science（李佩佩，郭遠明，陳雪昌，等. 食品科學(xué)），2013，34（3）：303

［3］ Yue Z F，Xie L Q，Chen X X，et al. Journal of Instrumental Analysis （岳振峰，謝麗琪，陳小霞，等. 分析測試學(xué)報），2008，27（3）：240

［4］ Huang W J，Hong J W，Jiang Z J，et al. Guangzhou Chemical Industry （黃文靜，洪建文，蔣忠軍，等. 廣州化工），2010，38（6）：150

［5］ Ministry of Health of the People’s Republic of China. Hygienic Standard for Cosmetics （中華人民共和國衛(wèi)生部. 化妝品衛(wèi)生規(guī)范），2007

［6］ Zheng Y M，Guo X D，Xian Y P，et al. Journal of Instrumental Analysis （鄭艷明，郭新東，冼燕萍，等. 分析測試學(xué)報），2009，28（2）：235

［7］ Pan Y，Niu H，Cheng X Y，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （潘媛，牛華，程曉云，等. 分析試驗室），2011，30（5）：69

［8］ Zhu Y，Zhang H. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology （祝穎，張虹. 中國食品學(xué)報），2010，10（2）：206

［9］ Bao X L，Ren Y P，Zhang H. Chinese Journal of Analytical Chemistry （包曉麗，任一平，張虹. 分析化學(xué)），2009，37（3）：389

［10］ Wu X L，Xiang L，Mo C H，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （吳小蓮，向壘，莫測輝，等. 分析化學(xué)），2013，41（6）：876

［11］ Lin F，Lin H D，Wu Y X. Journal of Instrumental Analysis （林峰，林海丹，吳映璇. 分析測試學(xué)報），2004，23（5）：43

［12］ Li Y L，Hao X L，Ji B Q，et al. Food Science （李雅麗，郝曉蕾，冀寶慶，等. 食品科學(xué)），2008，29（8）：502

［13］ Chen T，Chen A Z，Yang Z，et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （陳濤，陳安珍，楊釗. 藥物分析雜志），2010，30（6）：1087

［14］ GB／T 21312-2007

［15］ Yang F，Pang G F，Liu Z C，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （楊方，龐國芳，劉正才，等. 分析試驗室），2008，27（12）：27

［16］ Yue Z F，et al，ed. Guide for Veterinary Drug Residues in Food. Beijing：Standards Press of China （岳振峰，等，編. 食品中獸藥殘留檢測指南. 北京：中國標準出版社），2010

［17］ Wang L，Zhong D L，Chen G C，et al. Chinese Journal of Chromatography （王麗，鐘冬蓮，陳光才，等. 色譜），2013，31（10）：1010

［18］ Xu L，Xu Z W，Chen W H，et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory （徐莉，徐志偉，陳文慧，等. 分析試驗室），2012，31（9）：114

［19］ Cao P，Mou Y，Gao F，et al. Chinese Journal of Chromatography （曹鵬，牟妍，高飛，等. 色譜），2013，31（9）：862

［20］ Zheng J，Huang X R，Zheng J C，et al. Chinese Journal of Health Laboratory Technology （鄭晶，黃曉蓉，鄭俊超，等.中國衛(wèi)生檢驗雜志），2006，16（1）：79

［21］ Lu X R，Huo R F，Xu H D，et al. Journal of Environment and Health （盧曉蕊，霍任鋒，許海東，等. 環(huán)境與健康雜志），2013，30（6）：518

［22］ Chen J，Zheng R，Ji S，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （陳靜，鄭榮，季申，等. 分析化學(xué)），2013，41（6）：931