白海紅， 范 超， 沈丙權(quán)， 田 芳， 鄧玉林，潘一廷 ， 秦偉捷* ， 錢小紅

（1. 北京理工大學生命學院，北京100081；2. 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京蛋白質(zhì)組研究中心，蛋白質(zhì)組學國家重點實驗室，北京102206；3. 北京石油化工學院化學工程學院，北京102617）

N-糖基化修飾作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與了幾乎所有重要的生理過程，例如受精、發(fā)育、免疫應答、細胞間識別及通訊等［1，2］。蛋白質(zhì)N-糖鏈的組成和結(jié)構(gòu)對糖基化蛋白質(zhì)的構(gòu)象、功能以及與其他生物分子的相互作用都具有巨大的影響。大量研究表明，多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都伴隨著蛋白質(zhì)N-糖鏈組成和結(jié)構(gòu)的改變，如腫瘤、自身免疫疾病、糖尿病等［3，4］。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度的蛋白質(zhì)N-糖鏈鑒定技術(shù)對于闡明糖鏈在各個生理過程和疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用以及篩選臨床診斷標志物尤為重要。但是N-糖鏈本身含量有限，并具有高度微不均一性，同時質(zhì)譜分析信號易受高豐度蛋白質(zhì)、肽段、核酸及鹽類等的干擾［5］，因此，對N-糖鏈進行高效、高選擇性的富集是實現(xiàn)其高靈敏度鑒定的必要前提。

目前常用的N-糖鏈富集方法主要有凝集素法［6，7］、硼酸富集法［8，9］及親水相互作用色譜法［10，11］等。其中，親水相互作用色譜法利用較強親水性的N-糖鏈可以與氨基、酰胺基、羥基等親水基團形成氫鍵、偶極作用和靜電相互作用的特性，使用鍵合了親水基團的色譜填料有效保留糖鏈，達到特異性富集并與蛋白質(zhì)和多肽分離的目的。常用的親水填料一般是在硅膠填料表面鍵合單層兩性離子、乙二醇結(jié)構(gòu)或酰胺等基團，但其親水性有限，對于復雜樣品中低豐度N-糖鏈的分離富集選擇性不高［12，13］。我們利用表面引發(fā)-原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（SI-ATRP）方法，以帶有雙鍵的氨基葡萄糖為單體（GMAG），成功制備了新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料（pGMAG-SiO2），并將其用于麥芽七糖（DP7）、雞卵清蛋白（OVA）的N-糖鏈及人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集。SI-ATRP 方法可以在硅膠填料表面原位接枝高密度的聚合物，形成致密的親水聚合物層。由于聚糖結(jié)構(gòu)含有大量的羥基，在保持了硅膠填料較好的機械強度的同時，顯著提高了填料的親水性，有利于N-糖鏈的富集。本文以DP7 和OVA 的N-糖鏈為研究對象，考察了pGMAG-SiO2填料對N-糖鏈的富集效果，并將該填料用于人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集，共鑒定到47 種糖型。以上結(jié)果說明該填料可用于復雜生物樣本中蛋白質(zhì)N-糖鏈的高選擇性富集，并有助于提高糖蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的全面性。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

OVA 和胰蛋白酶（Trypsin，15 276 u／mg）購自美國Promega 公司；N-糖苷酶F（PNGase F）購自英國New England Biolabs 公司；2，5-二羥基苯甲酸（DHB）、三氟乙酸（TFA）、甲酸（FA）、DP7、三甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA），N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯三胺、氨基葡萄糖鹽酸鹽、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-APTES）、氰基硼氫化鈉、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）和5-甲氧基水楊酸均購自美國Sigma 公司；硅球（粒徑10 μm，孔徑20 nm）購于天津艾杰爾公司；去離子水由Milli-Q A10 純水系統(tǒng)制備；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。人血漿由中國人民解放軍空軍總醫(yī)院提供。

掃描電子顯微鏡（S4800 Field-Emission SEM）：工作電壓為20 kV；熱重分析儀（SDT Q600，美國TA 公司）：升溫速率5 ℃／min，氮氣保護。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）儀（4800 Proteomic Analyzer，AB SCIEX）用于糖鏈檢測：數(shù)據(jù)采集模式為正離子反射模式（positive reflector mode），加速電壓20 kV，掃描范圍為m／z 900 ～3 000，激光能量為6 000，總激光發(fā)射脈沖次數(shù)為1 000，將質(zhì)譜圖平均累計得到最終的質(zhì)譜圖。在進行數(shù)據(jù)采集之前，用馬心肌紅蛋白（Myo）的胰蛋白酶酶解肽段作為標準物校準儀器，使其絕對準確度達到0.1 Da，相對標準偏差達到10×10-6（10 ppm）。用Date Explorer Software 4.5進行譜圖分析?；|(zhì)為10 mg／mL 2，5-二羥基苯甲酸的50% （v／v）乙腈和50% （v／v）的0.1% 三氟乙酸溶液。取1 μL 待分析樣品置于不銹鋼板上使其自然風干，然后取1 μL 基質(zhì)使樣品充分結(jié)晶以待分析。將MALDI-TOF MS 生成的原始文件上傳到由Haslam 等［14］編寫的軟件GlycoWorkbench，以確定糖鏈結(jié)構(gòu)。將實驗所得的質(zhì)譜峰和Carbbank 庫（美國復合糖研究中心（CCRC）創(chuàng)建）中收錄的糖鏈的m／z 值進行匹配，得到糖鏈的結(jié)構(gòu)，最后將所有匹配的糖型結(jié)構(gòu)采用報告的形式呈現(xiàn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 pGMAG-SiO2的制備

首先制備GMAG，具體步驟如下：將1 mL GMA 和0.2 mol／L 硫酸混合后置于50 ℃水浴中加熱4 h，加入終濃度為10 mmol／L 的高碘酸鈉，室溫下避光放置1 h。將處理好的GMA 逐滴加到溶解有0.4 g 氫氧化鈉和2 g 氨基葡萄糖鹽酸鹽的20 mL 甲醇中，同時加入10 mmol NaBH3CN，攪拌直至溶液變?yōu)辄S色透明液，減壓蒸干至膏狀，密閉充氮氣后放置于4 ℃下保存。

然后制備pGMAG-SiO2雜化填料，具體步驟如下：引發(fā)劑制備參照文獻［15，16］中描述的步驟進行。在硅膠顆粒（粒徑10 μm，孔徑20 nm）中加入1 mol／L 的鹽酸（按1 g 硅膠顆粒中加入10 mL 1 mol／L 鹽酸的比例），超聲處理30 min，浸泡12 h 后用去離子水洗滌數(shù)次，直至pH 為中性。離心去除液體并將所得硅膠顆粒在80 ℃真空干燥箱中放置3 h。將處理后的硅膠與引發(fā)劑混合過夜，然后用甲醇清洗數(shù)次，加入ATRP 反應液（0.01 mol／L CuCl，0.015 mol／L N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯三胺，0.001 mol／L CuCl2和2 mol／L GMAG），室溫下反應24 h。聚合反應結(jié)束后，用甲醇清洗以去除未反應的反應物和其他雜質(zhì)。將制備得到的pGMAG-SiO2雜化填料在真空下干燥后備用。

1.2.2 糖蛋白N-糖鏈的制備

標準糖蛋白：將0.1 mg OVA 溶解于0.1 mL 50 mmol／L NH4HCO3溶液（pH 7.8）中，在95 ℃水浴中加熱10 min，冷卻后加入PNGase F 酶（按0.1 mg蛋白質(zhì)對應10 U 酶的比例），于37 ℃下放置12 h，得到其N-糖鏈。

人血漿樣品：將人血漿在4 ℃、16 000 g 離心力下離心30 min 除脂。然后使用50 mmol／L NH4HCO3溶液將其蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度稀釋至1 mg／mL。余下操作同標準糖蛋白N-糖鏈的制備。

1.2.3 pGMAG-SiO2雜化填料富集純化N-糖鏈

使用pGMAG-SiO2填料自制固相萃取柱用于DP7 寡糖和N-糖鏈的富集，主要操作步驟如下：稱取1 ～2 mg pGMAG-SiO2填料，用乙腈分散后裝填于200 μL 的tip 頭中；將填充的小柱活化平衡好之后，將糖鏈用乙腈／水（80 ∶20，v／v）溶液溶解，慢慢注入小柱中；隨后用100 μL 乙腈／水／甲酸（80 ∶20 ∶0.1，v／v／v）淋洗小柱3 次以去除蛋白質(zhì)和其他非極性物質(zhì)；最后用乙腈／水／甲酸（10 ∶90 ∶0.1，v／v／v）洗脫劑洗脫糖鏈，并將洗脫液置于MALDI-TOF MS 樣品靶上，加入基質(zhì)進行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 pGMAG-SiO2 的制備與表征

2.1.1 pGMAG-SiO2的掃描電鏡譜圖

首先，將單體GMA 上的環(huán)氧基氧化為醛基，利用醛基和氨基葡萄糖上氨基的共價反應制備帶有雙鍵可用于ATRP 反應的含糖單體GMAG。然后，合成SI-ATRP 引發(fā)劑，該引發(fā)劑一端為ATRP 引發(fā)劑，另一端為能與硅膠填料表面鍵合的硅烷偶聯(lián)劑，可以利用硅烷偶聯(lián)劑與硅膠填料表面的硅羥基共價連接，將SI-ATRP 引發(fā)劑固定在硅膠顆粒表面。最后，以GMAG 為單體，氯化亞銅為催化劑，N，N，N′，N″，N″-五甲基二乙烯三胺為配體，在硅膠顆粒表面引發(fā)ATRP 反應原位生成葡萄糖聚合物鏈，制備新型核殼型親水聚合物-硅膠雜化填料pGMAGSiO2。利用掃描電鏡對聚合物修飾的硅膠顆粒和沒有處理的硅膠顆粒進行表征。從圖1 中可以看出，未經(jīng)修飾的硅膠顆粒表面比較光滑，經(jīng)過聚合物修飾之后的顆粒表面粗糙度增加。證明通過SI-ATRP 方法在硅膠顆粒表面成功修飾了親水聚合物。

圖1 （a）未經(jīng)修飾的硅膠顆粒和（b）pGMAG-SiO2顆粒的掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of （a）bare silica particles and （b）pGMAG-SiO2 particles

2.1.2 熱重分析

pGMAG-SiO2填料包含可熱分解的聚合物層和不可熱分解的硅膠顆粒兩部分。從圖2 可看出，未經(jīng)任何處理的硅膠填料在40 ～990 ℃溫度范圍內(nèi)隨熱處理溫度的提高無明顯的質(zhì)量損失；而經(jīng)親水聚合物修飾的硅膠雜化填料隨熱處理溫度的提高，質(zhì)量損失高達20%，這是硅膠上的pGMAG 聚合物熱分解所導致的。這證明通過SI-ATRP 法可以在硅膠填料表面原位聚合生成大量的親水聚合物pGMAG。大量羥基的存在增強了pGMAG-SiO2雜化填料的親水性，從而提高了其對N-糖鏈的保留作用，有望對N-糖鏈有高效的富集。

圖2 未經(jīng)修飾的硅膠填料和pGMAG-SiO2 雜化填料的熱重分析圖Fig.2 Thermogravimetric analysis of bare silica microparticles and pGMAG-SiO2 packing

2.2 pGMAG-SiO2 對糖蛋白N-糖鏈的富集

基于pGMAG-SiO2雜化填料的蛋白質(zhì)N-糖鏈富集路線如圖3 所示。將蛋白質(zhì)變性后，使用PNGase F 酶將糖鏈釋放，隨后用pGMAG-SiO2雜化填料對N-糖鏈進行富集，將蛋白質(zhì)、多肽和其他雜質(zhì)淋洗去除后，洗脫糖鏈并進行質(zhì)譜鑒定。

圖3 基于pGMAG-SiO2 雜化填料的糖蛋白N-糖鏈富集路線圖Fig.3 Schematic diagram of N-glycan enrichment by pGMAG-SiO2 packing

2.2.1 pGMAG-SiO2對標準寡糖樣品的富集

首先使用標準寡糖DP7 評價了該親水填料在微量糖鏈富集鑒定中應用的可能性。按照圖3 所示流程，將1 μg DP7 上樣、淋洗、洗脫后進行MALDITOF MS 鑒定。富集前DP7 的質(zhì)譜絕對信號強度為2.4×104（m／z 1 175.0）（見圖4a）；使用乙腈／水／甲酸（80 ∶20 ∶0.1，v／v／v）淋洗之后，淋洗液在m／z 1 175處只有極弱的質(zhì)譜峰（見圖4b）；使用乙腈／水／甲酸（10 ∶90 ∶0.1，v／v／v）洗脫后，在m／z 1 175 處觀測到較強的質(zhì)譜峰信號（見圖4c），且信號強度和富集前相差不多。這說明糖鏈可以在高比例的有機相條件下通過親水相互作用保留在該親水性硅膠雜化填料上，在高比例水相的條件下被洗脫，因此可以濃縮糖鏈樣品提高質(zhì)譜檢測的信號強度。同時我們也考察了糖鏈在pGMAG-SiO2填料上的回收率，通過測定不同濃度的DP7 在m／z 1 175 處對應的質(zhì)譜峰面積，建立標準曲線，使用外標法計算得到pGMAGSiO2雜化填料對DP7 的回收率為91.2%，說明pGMAG-SiO2雜化填料對糖鏈具有較高的回收率。

圖4 DP7 經(jīng)（a）pGMAG-SiO2 雜化填料富集前、（b）淋洗液和（c）富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.4 MALDI-TOF MS spectra of DP7 （a）before enrichment，（b）washing and （c）after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

2.2.2 pGMAG-SiO2對標準糖蛋白N-糖鏈的富集

為了進一步評價pGMAG-SiO2雜化填料在糖蛋白N-糖鏈富集檢測中的應用，我們對標準糖蛋白上釋放的N-糖鏈進行了富集檢測。使用PNGase F釋放OVA 標準糖蛋白的N-糖鏈，經(jīng)pGMAG-SiO2雜化填料富集之后進行MALDI-TOF MS 分析。從圖5a 可以看出，未經(jīng)任何富集處理只能檢測到14個糖鏈對應的質(zhì)譜峰，且信號強度較弱，信噪比（S／N）較低。經(jīng)過pGMAG-SiO2雜化填料富集后可以鑒定到21 個糖鏈（對應的糖型結(jié)構(gòu)見表1），與文獻［17］報道數(shù)量一致，并且信號強度較強，S／N 較高（見圖5b）。對于富集前、后均檢測到的糖型信號，富集后的信號強度為富集之前的1 ～9.7 倍（見表1）。以上數(shù)據(jù)證明了pGMAG-SiO2雜化填料由于包裹了致密的葡萄糖聚合物層，具有較強的親水性，對不同糖型的N-糖鏈均有良好的保留能力，適用于N-糖鏈的無偏性富集鑒定。

圖5 OVA 的N-糖鏈經(jīng)pGMAG-SiO2（a）富集前和（b）富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.5 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from OVA （a）before and （b）after enrichment by pGMAG-SiO2 packing

表1 pGMAG-SiO2 富集前、后質(zhì)譜鑒定到的OVA 的N-糖鏈的糖型Table 1 Identified N-glycoforms of OVA before and after enrichment by pGMAG-SiO2

2.2.3 pGMAG-SiO2用于人血漿中糖蛋白N-糖鏈的富集

已經(jīng)有文獻報道，人血漿中糖蛋白的糖型結(jié)構(gòu)改變和多種癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系，例如乳腺癌、前列腺癌及肝癌等［18-20］。因此鑒定人血漿中糖蛋白的N-糖鏈結(jié)構(gòu)有利于發(fā)現(xiàn)多種癌癥診斷生物標志物，為這些疾病的臨床研究及藥物研發(fā)提供有價值的數(shù)據(jù)。對血漿糖蛋白經(jīng)PNGase F 酶解釋放的N-糖鏈直接進行MALDI-TOF MS 檢測，只能鑒定到11 種糖型，并且信號強度較差，S／N 較低（見圖6a）。使用本文制備的新型核殼型pGMAG-SiO2雜化填料富集后，可以鑒定到47 種糖型（見圖6b），包含了N-糖鏈的3 種糖型構(gòu)型（高甘露糖型、復合型和雜合型），比文獻報道的42 種糖型有所增加［21］。而且信號強度和S／N 也得到顯著改善，例如，MALDI-TOF MS 譜圖中的m／z 1 647.7 質(zhì)譜峰對應的是IgG 釋放的N-糖鏈Hex4HexNAc4Fuc1，經(jīng)過該親水填料富集之后S／N 提高了16 倍。N-糖鏈質(zhì)譜信號和信噪比的提高得益于該親水雜化填料能夠有效濃縮富集N-糖鏈，且在富集的同時又能夠有效去除血漿樣品中的非極性雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)及多肽等），降低了其對N-糖鏈質(zhì)譜信號的抑制。以上結(jié)果進一步說明了該親水雜化填料可以用于復雜生物樣本中N-糖鏈的高效且無偏性富集。

圖6 人血漿糖蛋白N-糖鏈經(jīng)pGMAG-SiO2（a）富集前和（b）富集后的MALDI-TOF MS 譜圖Fig.6 MALDI-TOF MS spectra of N-glycans from human plasma proteins

3 結(jié)論

采用SI-ATRP 反應在硅膠表面原位生成親水葡萄糖聚合物層，成功制備了新型核殼型葡萄糖聚合物-硅膠雜化填料。由于葡萄糖親水聚合物的修飾，該填料具有高度親水性，特別適合親水作用色譜（HILIC）模式下糖鏈的富集分離。該雜化填料已被成功應用于標準糖蛋白和復雜生物樣本中糖蛋白的N-糖鏈富集，從人血漿糖蛋白中成功富集鑒定到47種糖型，顯示了其在糖蛋白質(zhì)組學研究中的應用潛力。

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