楊向祎，郭穎，曹小芳，賈艷飛，王曉尉，許劍鋒，周芳，李鴻，梁小薇，盧文紅＊，谷翊群＊

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

表觀遺傳學(xué)是指在細(xì)胞核DNA 序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表型發(fā)生穩(wěn)定的可遺傳的變化。例如DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑，這些修飾可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)育及個(gè)體成熟過(guò)程中起著重要的作用，還可以遺傳給子代［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要組成部分，指由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶催化，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（5mC），即在CpG二核苷酸內(nèi)將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5位碳原子上。我國(guó)學(xué)者（2013）指出，精子而非卵子的DNA甲基化圖譜可遺傳給子代，子代選擇性地繼承父代而拋棄母代的DNA 甲基化圖譜，并用于指導(dǎo)胚胎早期發(fā)育［2］。胚胎早期的DNA 甲基化異常可以導(dǎo)致男性不育及胎兒印記基因缺陷性疾病，如Beckwith-Wiedeman 綜合征、Silver-Russell綜合征，以及Angelman 綜 合 征（Angelman syndrome，AS）／Prader-Willi 綜 合 征 （Prader-Willi syndrome，PWS）。

精子低溫冷凍保存技術(shù)已廣泛應(yīng)用于男性惡性腫瘤放化療前、輸精管絕育術(shù)前、輔助生殖技術(shù)中的自身精液或精子庫(kù)捐精的精子保存［3］。雖然隨著冷凍方法和冷凍保護(hù)劑的不斷改良，使精子的存活率有了一定提高，但對(duì)精子活力、頂體反應(yīng)發(fā)生率、形態(tài)學(xué)及授精能力仍然會(huì)造成了一些不可逆轉(zhuǎn)的影響，而對(duì)表觀遺傳方面的損傷，至今仍然沒(méi)有確切結(jié)論。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)大量報(bào)道了輔助生殖技術(shù)會(huì)影響胚胎早期發(fā)育，甚至導(dǎo)致子代因表觀遺傳學(xué)改變所致的遺傳缺陷，包括較高的生殖功能障礙、腫瘤及印記缺陷性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等［4］。印記基因DNA 甲基化程度容易受外界環(huán)境如溫度［5］、營(yíng)養(yǎng)供給［6］、重金屬［7］、早期環(huán)境刺激［8］和輻射［9］等的影響，從而發(fā)生甲基化程度的異常。冷凍技術(shù)是否會(huì)對(duì)精子印記基因DNA 甲基化程度產(chǎn)生影響鮮有報(bào)道，本研究旨在對(duì)此進(jìn)行初步探討。

材料與方法

一、樣品采集與分組

1.精液樣品收集：選取10例北京人類精子庫(kù)符合捐精條件的正式志愿者為研究對(duì)象［10］。經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及本人知情同意，所取精液全部用于本次實(shí)驗(yàn)。依據(jù)第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》［11］，志愿者禁欲3～5d，手淫法取精，精液完整收集于無(wú)菌干燥取精杯中，置37℃水浴中液化

0.5～1h。

2.精液分組：將完全液化的精液樣品平均分為4組：A 組為0.5ml新鮮精液，作為對(duì)照；B組0.5ml新鮮精液加入0.5ml冷凍保護(hù)劑（自制），37 ℃水浴10min，不冷凍；C 組0.5 ml新鮮精液加入0.5ml冷凍保護(hù)劑，冷凍2d；D 組0.5 ml新鮮精液加0.5ml冷凍保護(hù)劑，冷凍兩個(gè)月。

二、研究方法

1.精液冷凍復(fù)蘇：本研究采用精子庫(kù)常用的甘油-卵黃-檸檬酸鹽冷凍保護(hù)劑（自制）以及液氮程控冷凍降溫法對(duì)精子進(jìn)行冷凍，復(fù)蘇時(shí)采用37℃水浴快速?gòu)?fù)溫5～10min［11］。

2.精子DNA 提?。壕覦NA 的提取使用微量全基因組DNA 提取試劑盒（Omega，美國(guó)），每500μl樣品加用配制的1 mol／L 的DTT 液20μl處理細(xì)胞膜。Nano Drop2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）檢測(cè)DNA濃度與純度（OD260／OD280），每個(gè)樣品分裝3管，標(biāo)本置于-80℃保存。

3.亞硫酸氫鹽處理：使用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（Qiagen，德國(guó)）處理精子DNA，其原理為DNA序列中CpG 島內(nèi)（5mCG）甲基化胞嘧啶（C）保持不變，未甲基化的胞嘧啶（C）都轉(zhuǎn)化成尿嘧啶（U），經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增后，U 轉(zhuǎn)化為胸腺胞嘧啶（T），分析PCR 產(chǎn)物中C／T 的含量（即C 的比值）可間接定量分析甲基化程度。

4.目的片段擴(kuò)增：目的區(qū)域?yàn)镠19 印記調(diào)控區(qū)（imprinting control regions，ICR）（GenBank accession no.AF087017，nucleotides 6 005～6 326），MEST ICR（GenBank accession no.Y10620，nucle-otides 609～898）［12］，PCR 用EX Taq HotStart試劑盒（TaKaRa，日 本），50μl反 應(yīng) 體 系 為：0.25μl TaKaRa Ex Taq HS、5μl 10×Ex Taq Buffer、4μl dNT PMixture、5μl甲基化后DNA、正反向引物各2.5μl、滅菌蒸餾水30.75μl。反應(yīng)置于冰上。PCR反應(yīng)條件列于表1。

5.PCR 產(chǎn)物電泳及純化回收：配置2%的瓊脂糖凝膠，將PCR 產(chǎn)物電泳，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。使用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit瓊脂糖凝膠回收試劑盒（全式金）對(duì)凝膠進(jìn)行目的片段的回收。

表1 引物序列及半巢氏PCR 反應(yīng)條件

圖1 H19甲基化后DNA PCR 電泳圖

圖2 MEST 甲基化后DNA PCR 電泳圖

6.TA 克隆測(cè)序：使用pEASY-T1Cloning Kit試劑盒（全式金），進(jìn)行目的片段DNA 與質(zhì)粒的連接。加連接產(chǎn)物于50μl感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物菌液均勻涂于LB 平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色單克隆至10μl無(wú)菌水中，取1μl混合液于25μl PCR 體系，用M13通用引物進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增來(lái)鑒定陽(yáng)性克隆，將產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。挑選含陽(yáng)性單克隆菌落的菌液，加入500μl平衡至室溫的液體LB培養(yǎng)基（含Kana抗生素，自制），200r／min，37 ℃培養(yǎng)3h左右。進(jìn)行基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用Chromas Lite 軟件（Technelysium Pty Ltd，澳大利亞）打開(kāi)，結(jié)果要求條帶清晰，無(wú)套峰等情況。采用BIQ-analyzer甲基化分析軟件（Max Planck Institution，德國(guó)）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析及質(zhì)控。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，Bonferroni法進(jìn)行多個(gè)樣品率的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H19甲基化結(jié)果分析

1.H19ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)分析：統(tǒng)計(jì)克隆數(shù)，H19總共測(cè)試了370個(gè)克隆，B、C、D 組的精子其H19ICR DNA 甲基化率以克隆數(shù)表示（甲基化克隆數(shù)占全部克隆數(shù)的百分比）時(shí)，與A 組相比，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)CpG 島數(shù)，目的片段含21 個(gè)CpG 島，H19共測(cè)試了7 770個(gè)CpG 島，H19ICR DNA 甲基化率以CpG 島數(shù)表示（甲基化CpG 島數(shù)占全部CpG 島的百分比）時(shí)，分別與對(duì)照A 組的97.57%相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3、表2）。

2.冷凍保護(hù)劑對(duì)精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影響：H19ICR DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，加冷凍保護(hù)劑的B組與未加冷凍保護(hù)劑的對(duì)照A 組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍保護(hù)劑對(duì)精子H19ICR的DNA 甲基化程度未見(jiàn)影響。（表2）。

3.冷凍過(guò)程及冷凍時(shí)間對(duì)精子H19ICR 的DNA 甲基化程度的影響：H19ICR DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，冷凍的C D 組與未冷凍的B 組相比，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；冷凍兩個(gè)月的D 組與冷凍兩天的C組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍過(guò)程及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子H19ICR 的DNA甲基化程度未見(jiàn)影響。（表2）。

二、MEST 甲基化結(jié)果分析

1.MEST ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)分析：MEST 總 共 測(cè) 了295 個(gè) 克 隆，B、C、D 組 的 精 子MEST ICR DNA 甲基化率以克隆數(shù)表示時(shí)與對(duì)照A 組相比，有升高趨勢(shì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。目的片段含有31個(gè)CpG 島，MEST 共測(cè)試了9 145個(gè)CpG 島，MEST ICR DNA 甲基化率以CpG 島數(shù)表示時(shí)，分別與對(duì)照A 組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3、圖4）。

圖3 H19ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的點(diǎn)狀圖（BIQ 軟件）

表2 四組H19ICR 甲基化狀態(tài)比較［n（%）］

2.冷凍保護(hù)劑對(duì)精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影響：MEST DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，加冷凍保護(hù)劑的B組與未加冷凍保護(hù)劑的對(duì)照A 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍保護(hù)劑對(duì)精子MEST ICR的DNA 甲基化程度未見(jiàn)影響。（表3）。

3.冷凍及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度的影響：MEST ICR DNA 甲基化率分別以克隆數(shù)和CpG 島數(shù)表示時(shí)，冷凍的C、D組與未冷凍的B 組相比，有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；冷凍2個(gè)月的D 組與冷凍2d的C組相比，差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，冷凍及冷凍時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)精子MEST ICR 的DNA 甲基化程度未見(jiàn)影響。（表3）。

圖4 MEST ICR CpG 各位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的點(diǎn)狀圖（BIQ 軟件）

表3 四組MEST ICR 甲基化狀態(tài)比較［n（%）］

討 論

印記基因是指同源基因中只選擇性的表達(dá)一方親本基因，另一方則不表達(dá)（最常見(jiàn)是由于DNA 甲基化），即呈現(xiàn)為差異性表達(dá)［13］。大多數(shù)印記基因都是成簇存在，通過(guò)不同的ICR 的順式作用來(lái)調(diào)節(jié)其基因的表達(dá)或抑制。在許多基因啟動(dòng)子區(qū)，其CpG 二聯(lián)核苷的概率高于正常，具有調(diào)控作用，被稱為CpG 島。CpG 島的DNA 高甲基化會(huì)在空間上阻礙轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物與DNA 鏈結(jié)合，抑制基因的表達(dá)，這些區(qū)域低甲基化能促使基因表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取印記基因的ICR 區(qū)，并對(duì)此區(qū)甲基化CpG 島進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可代表整個(gè)基因的甲基化程度。

DNA 甲基化印記是周期性動(dòng)態(tài)變化的，受精后胚胎細(xì)胞中從親代遺傳來(lái)的甲基化標(biāo)記在去甲基化酶的作用下被擦除，胚胎植入子宮內(nèi)膜前，新的甲基化標(biāo)記又在基因組DNA 上重建。與普通基因組DNA 不同，印記基因ICR 區(qū)在繼承父母雙方各自的DNA 甲基化印記后，不經(jīng)歷受精后擦除、重建的過(guò)程，能穩(wěn)定地遺傳下去［14］。一旦受精前精子印記基因DNA 甲基化受外界環(huán)境如低溫冷凍的刺激而發(fā)生異常，必然會(huì)影響到早期胚胎發(fā)育甚至子代身體健康。

父源印記基因H19 定位于人染色體11p15.5區(qū)，H19ICR 甲基化異常會(huì)導(dǎo)致男性不育、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限［15］及子代印記缺陷性疾病的發(fā)生［16］。母源印記基因MEST 定位于人類染色體7q31-34，MEST ICR 甲基化異常會(huì)導(dǎo)致Silver-Russell綜合癥（SRS）［16］的發(fā)生。因此選擇了這兩個(gè)分別來(lái)自父源和母源的目的基因開(kāi)展研究。

常用DNA 甲基化分析方法有：甲基化特異性PCR、亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法、亞硫酸鹽氫測(cè)序PCR、變性高效液相色譜、焦磷酸測(cè)序法、飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)、探針和芯片法等。本研究選擇的是亞硫酸氫鹽測(cè)序法雖然需要大量的克隆測(cè)序，過(guò)程較為繁瑣、昂貴，但可靠性及精確度很高，能明確目的片段中每個(gè)CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)選取精子庫(kù)入選的正式志愿者，無(wú)遺傳性疾病家族史，無(wú)外傷及性功能障礙史，并進(jìn)行了染色體核型分析，排除了少、弱精子癥及染色體核型異常等因素的干擾。Collodel等［17］報(bào)道，冷凍保護(hù)劑會(huì)通過(guò)氧化應(yīng)激對(duì)精子線粒體等微結(jié)構(gòu)造成損傷。因此，本研究設(shè)置了未加保護(hù)劑的A 組和加保護(hù)劑的B組，本結(jié)果顯示，保護(hù)劑的使用未對(duì)DNA 甲基化造成明顯影響。Flores等［18］報(bào)道，冷凍對(duì)精子線粒體相關(guān)功能及蛋白的損傷是時(shí)間依賴性的。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)冷凍2d的C 組及冷凍2個(gè)月D組的比較，隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)，DNA 甲基化程度有增高趨勢(shì)，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。國(guó)外學(xué)者用焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)冷凍4周的精子，檢測(cè)了9個(gè)基因，其結(jié)果亦未見(jiàn)影響［19］，本文與其檢測(cè)的結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)研究了冷凍技術(shù)、精液冷凍保護(hù)劑及冷凍時(shí)間對(duì)精子DNA 甲基化的影響，雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯示這些因素都未對(duì)精子印記基因DNA 甲基化產(chǎn)生影響，但H19DNA 甲基化程度隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)有降低趨勢(shì)，MEST DNA 甲基化程度隨冷凍時(shí)間延長(zhǎng)有升高趨勢(shì)，且3號(hào)志愿者M(jìn)EST DNA 甲基化出現(xiàn)了異質(zhì)性，說(shuō)明冷凍技術(shù)可能對(duì)某些特定人群DNA 甲基化產(chǎn)生影響。受條件限制，本實(shí)驗(yàn)冷凍時(shí)間未達(dá)到臨床保存所需的時(shí)間要求。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，可通過(guò)擴(kuò)大樣品量、延長(zhǎng)冷凍時(shí)間及增加候選基因個(gè)數(shù)，進(jìn)一步研究與分析個(gè)體差異，為精子冷凍保護(hù)劑的改良、冷凍保存安全性評(píng)估提供參考依據(jù)。

致謝：感謝國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所出生缺陷干預(yù)實(shí)驗(yàn)室王啟迪、曹小芳、郭昌龍等對(duì)本實(shí)驗(yàn)提供的技術(shù)支持。

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