許小英，李夢耀，馬嵐，張敏，同祿祿

(1.長安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054;2.旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點實驗室(長安大學(xué))，陜西 西安 710054)

黃酮類化合物具有擴張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、調(diào)血脂和抗腫瘤等藥理作用［1-2］。近年來，銀杏葉黃酮的提取和測定方法研究十分活躍［3］。銀杏黃酮的測定方法主要有紫外分光光度法［4］、熒光光度法［5］、高效液相色譜法［6］、薄層掃描法［7］、毛細管電泳法等［8］。本文依據(jù)銀杏黃酮的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的特點，建立并采用溴量法對黃酮類化合物的含量進行測定，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度，操作方法簡單、快捷、經(jīng)濟，適合于測定天然產(chǎn)物提取液中黃酮的含量。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

黃酮標(biāo)準(zhǔn)(蘆丁)、溴酸鉀、溴化鉀、碘化鉀、硫代硫酸鈉等均為分析純;重鉻酸鉀，優(yōu)級純;蒸餾水;銀杏樹葉(金黃色，洗凈，陰干)。

AL204 電子天平;101-2AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱;THZ-82 恒溫振蕩器。

1.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的配制

準(zhǔn)確稱取黃酮標(biāo)準(zhǔn)品0.664 6 g，加入少量乙醇微熱至完全溶解，轉(zhuǎn)移到200 mL 的容量瓶中，冷卻到室溫后，蒸餾水定容至刻度，即得到5 mmol/L 的黃酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.3 測定原理

銀杏葉中所含的黃酮類化合物主要是黃酮醇苷類成分［9-10］，其分子結(jié)構(gòu)含有酚羥基，在一定條件下，可與溴分子發(fā)生親電取代反應(yīng)，只要能夠確定與一分子黃酮起反應(yīng)的溴分子數(shù)，就可用溴量法測定黃酮的含量。

測定原理用反應(yīng)方程式表示如下:

Br2的生成 5KBr+KBrO3+6HCl→3Br2+3H2O+6KCl

取代 黃酮 +zBr2→取代產(chǎn)物+zHBr

滴定 Br2(剩余)+ 2KI →I2+ 2KBr

平行進行空白實驗，確定加入溴的總量，用黃酮標(biāo)準(zhǔn)作為樣品進行實驗，計算反應(yīng)系數(shù)z。

式中 z——與1 分子黃酮進行反應(yīng)的Br2分子數(shù);

1.4 測定方法

準(zhǔn)確移取黃酮標(biāo)準(zhǔn)液(或銀杏黃酮提取液)10.00 mL 于250 mL 碘量瓶中，加入0.05 mol/L 的溴試劑10.00 mL，微開瓶塞，加入6 mol/L 的鹽酸3.00 mL，立即蓋上瓶塞，用少量蒸餾水封口，稍微振蕩，置于暗處30 min。微開瓶塞，加入10%的碘化鉀5.0 mL，立即蓋上瓶塞，搖勻放置5 min。加氯仿2 mL，輕輕振蕩，使沉淀溶解。用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進行滴定，當(dāng)溶液顏色變?yōu)闇\黃色時，加入2 mL淀粉指示劑，滴定直至溶液藍色褪去，即為滴定終點。平行進行空白實驗。按下式計算銀杏提取液中黃酮的濃度。

式中 cH——樣品溶液中銀杏黃酮的濃度，mg/L;

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮與Br2反應(yīng)系數(shù)的確定

2.1.1 反應(yīng)時間 保持溶液的酸度不變，加入溴的物質(zhì)量為黃酮的7 倍，考察反應(yīng)時間對反應(yīng)系數(shù)的影響，結(jié)果見表1。

由表1 可知，反應(yīng)時間對反應(yīng)系數(shù)的影響不大，但是反應(yīng)時間短，反應(yīng)不完全;而反應(yīng)時間較長時，溴又易揮發(fā)，不利于反應(yīng)系數(shù)的測定，綜合考慮，選擇30 min 作為最佳反應(yīng)時間。

表1 反應(yīng)時間對反應(yīng)系數(shù)的影響Table 1 The impact of reaction time on reaction coeffient

2.1.2 鹽酸用量 其他因素不變，反應(yīng)時間為30 min 時，考察6 mol/L 鹽酸用量對反應(yīng)系數(shù)的影響，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸用量對反應(yīng)系數(shù)的影響Table 2 The impact of HCl amount on reaction coeffient

由表2 可知，鹽酸用量對反應(yīng)系數(shù)的影響不顯著。但加入鹽酸量較少時，使溴產(chǎn)生的不完全，影響反應(yīng)系數(shù)的測定，選擇加入的酸量為3.0 mL。

2.1.3 溴試劑用量 由表3 可知，在保證溴過量的情況下，溴試劑的量對反應(yīng)系數(shù)沒有顯著影響，但溴試劑的加入量也不宜過多。通常情況下，溴過量20%即可，取n(Br2)∶n(黃酮)=5∶1。

表3 溴試劑用量對反應(yīng)系數(shù)的影響Table 3 The impact of bromine reagent amounton reaction coeffient

2.2 樣品分析

準(zhǔn)確稱取10 g 干的銀杏葉于250 mL 圓底燒瓶中，加入60 mL 95%乙醇，在恒溫水浴鍋中，60 ℃下回流90 min，傾倒出濾液。重復(fù)上述步驟3 次，合并4 次提取液，取上清液測定銀杏黃酮的含量，結(jié)果見表4。

由表4 可知，10 次測定同一銀杏黃酮提取液，黃酮的平均濃度為1.674 g/L，各次測定數(shù)值接近，說明溴量法測定銀杏黃酮提取液重現(xiàn)性較好。

表4 銀杏黃酮樣品含量測定結(jié)果Table 4 The content measurement results of Ginkgo biloba extract sample

2.3 精密度

實驗數(shù)據(jù)的精密度分析結(jié)果見表5。

表5 銀杏黃酮標(biāo)準(zhǔn)品精密度分析結(jié)果Table 5 The accuracy analysis results of Ginkgo biloba extract standard sample

由表5 可知，對提取液1 和提取液2，10 次測定標(biāo)準(zhǔn)偏差都較小，說明測定方法具有良好的可信度。

2.4 準(zhǔn)確度

對樣品進行加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表6。

表6 銀杏黃酮加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 6 The add mark recovery rate measurement results of Ginkgo biloba extract

由表6 可知，溴量法測定銀杏黃酮提取液的加標(biāo)回收率為97. 6% ～98. 8%，該方法較為準(zhǔn)確，可靠。

3 結(jié)論

(1)依據(jù)黃酮可以和溴分子發(fā)生親電取代反應(yīng)，建立了一種溴量法測定黃酮的新方法，實驗測得1 分子黃酮與5 分子溴反應(yīng)親電取代反應(yīng)，溴與黃酮反應(yīng)系數(shù)比為5∶1。

(2)溴量法測定1.674 g/L 銀杏黃酮提取液，10次測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.48 ×10－5，加標(biāo)回收率為97.6%，98.8%，方法準(zhǔn)確、可靠，適用于天然植物提取液中黃酮的測定。

［1］ Xiong X J，Liu W，Yang X C.Ginkgo biloba extract for essential hypertension:A systemic review［J］. Phytomedicine，2014(21):1131-1136.

［2］ Cook N C，Samman S.Flavonoids-Chemistry，metabolism，cardioprotective-effects，and dietary sources［J］. Nutritional Biochemistry，1996，7(2):66-76.

［3］ 呂幫玉，楊新河，毛清黎. 銀杏葉黃酮提取與測定研究進展［J］.河北農(nóng)業(yè)科技，2007，11(3):91-95.

［4］ 潘見，駱祥峰，王國霞.紫外分光光度法測銀杏黃酮苷含量誤差分析［J］. 合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，23(4):464-467.

［5］ 張敏，邱朝暉，曹庸，等. Al3+-蘆丁二元絡(luò)合物熒光光度法測定銀杏葉中總黃酮的含量［J］.分析科學(xué)學(xué)報，2005，21(2):188-190.

［6］ 王靖，鄒雨佳，唐華澄，等.高效液相色譜法(HPLC)測定銀杏黃酮含量［J］. 食品工業(yè)科技，2006(3):184-186.

［7］ 郭雪峰，岳永德.黃酮類化合物的提取、分離純化和含量測定方法的研究進展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(26):8083-8086.

［8］ 陸敏，張文娜.銀杏葉中黃酮類化合物的提取、純化及測定方法的研究進展［J］. 理化檢驗-化學(xué)分冊，2012，45(5):616-620.

［9］ 王成章，林祥. 銀杏葉中黃酮類化合物及其分析方法［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1996，18(1):83-88.

［10］胡衛(wèi)兵，瞿萬云，吳遵義，等. 銀杏葉中總黃酮含量的庫侖滴定法［J］.化工科技，2003，11(1):42-44.