文∕賈 濤

（北京市飼料監(jiān)察所）

四環(huán)素類藥物（tetracyclines，TCs）為一類具有共同多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、螺旋體、霉形體、立克次氏體、衣原體、原蟲等均可產(chǎn)生抑制作用，故又稱為廣譜抗生素。但該類藥物的不合理使用及濫用會誘導(dǎo)動物體內(nèi)耐藥菌株的產(chǎn)生并可導(dǎo)致牛奶中該類藥物的殘留問題，對人類健康造成影響，如四環(huán)素類藥物易與骨骼中的鈣結(jié)合，抑制骨骼和牙齒的生長；治療劑量的四環(huán)素還具有致癌作用等。本文以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中的四環(huán)素類藥物殘留，結(jié)果表明，該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。

1 方法

試料中殘留的四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素經(jīng)Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液提取，HLB柱凈化。用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。

2 試劑和儀器設(shè)備

2.1 試劑

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸四環(huán)素（純度≥97%），鹽酸土霉素（純度≥96%），鹽酸金霉素（純度≥93%），多西環(huán)素（純度≥93%）；甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；甲酸；氫氧化鈉；檸檬酸（C6H8O7?H2O）；磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）；乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8?2H2O）；氫氧化鈉溶液（1 mol/L）：稱取氫氧化鈉4 g，加水溶解并稀釋至100 mL，即得；檸檬酸溶液（0.1 mol/L）：稱取21.01 g檸檬酸，用水溶解并定容至1 000 mL，即得；磷酸氫二鈉溶液（0.2 mol/L）：稱取28.41 g磷酸氫二鈉，用水溶解并定容至1 000 mL，即得；Mcllvaine緩沖液：將0.1 mol/L檸檬酸溶液1 000 mL與0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液625 mL混合，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至4.0±0.5；Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液（0.1mol/L）：稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入 1 625 mL Mcllvaine緩沖液中，使其溶解，搖勻即得；1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素和鹽酸金霉素對照品適量，用甲醇溶解并稀釋成濃度均為1 mg/mL的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置-20 ℃冰箱中保存，有效期為1 個月；標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇-水（3∶7，V/V）溶液稀釋成適宜濃度的四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用前配制。

2.2 儀器和設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）；分析天平：感量0.00001 g；天平：感量0.01 g；渦旋混合器；水平振蕩器；組織勻漿機(jī)；離心機(jī)；酸度計；離心管：50 mL；固相萃取柱：HLB小柱（60 mg/3 cc）；氮吹儀；微孔濾膜：0.22 μm。

3 測定步驟

3.1 試料的制備

取混勻后的供試樣品，作為供試試料；取混勻后的空白樣品，作為空白試料；取混勻后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。

3.2 提取

稱取（2±0.05）g混合均勻的牛奶樣品，置50 mL離心管中，加Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液18 mL，渦旋混勻，8 000 r/min離心10 min（溫度低于15 ℃），取上清液于另一離心管內(nèi)備用。

3.3 凈化

HLB小柱依次用甲醇、水各5 mL預(yù)洗。取備用液10 mL過柱，依次用水、5%甲醇水溶液各5 mL淋洗，減壓抽干。用甲醇-乙酸乙酯溶液（1∶9，V/V）3 mL洗脫，洗脫液用氮氣吹干（溫度低于40 ℃）。用甲醇-水（3∶7，V/V）0.5 mL溶解殘余物，過濾膜后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇-水（3∶7，V/V）溶液稀釋成含四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素分別為10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列工作液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3.5 測定

3.5.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（5 mm0×2.1 mm，1.7 μm），或相當(dāng)者；流動相A：0.3%的甲酸乙腈溶液；流動相B：0.3%的甲酸水溶液；梯度洗脫：0～5 min，15%A線性變化至35%A，5～6 min，35%A線性變化至15%A。流速：0.3 mL/min；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

3.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓：2.5 kV；源溫：100 ℃；霧化溫度：300 ℃。錐孔氣流速：50 L/h；霧化氣流速：500 L/h；定性、定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量見表1。

3.5.3 測定方法

取試樣溶液和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點或多點校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以峰面積計算。對照溶液及試樣溶液中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)?？瞻讓嶒灒撼患釉嚵贤猓捎猛耆嗤臏y定步驟進(jìn)行平行操作。

3.5.4 結(jié)果計算和表述

按下式計算試料中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的殘留量：

式中:

X——試料中四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素的殘留量（ng/g）；

A——試樣溶液中相應(yīng)藥物的峰面積；

AS——標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)藥物的峰面積；

cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)藥物的濃度（ng/mL）；

V1——提取試料后緩沖液的總體積（mL）；

V2——過固相萃取柱所用備用液體積（mL）；

V3——溶解殘余物的體積（mL）；

m——供試試料的質(zhì)量（g）。

注：計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3 位有效數(shù)字。

3.6 檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

3.6.1 靈敏度

四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素在牛奶中的檢測限為5 ng/g，定量限為10 ng/g。

3.6.2 準(zhǔn)確度

本方法在10～200 ng/g添加濃度的回收率為70%～120%。

3.6.3 精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤20%，批間變異系數(shù)≤20%。

4 結(jié)果討論

4.1 研究用液質(zhì)聯(lián)用法檢測牛奶中四環(huán)素類藥物的意義

歐盟和我國政府都規(guī)定了牛奶中四環(huán)素類藥物的最高殘留限量，即四環(huán)素、土霉素和金霉素的單個或混合物含量不得超過100 μg/kg。目前，TCs類藥物殘留檢測方法主要有：微生物法、酶聯(lián)免疫法（ELISA法）和液相色譜法（HPLC法），但這些方法存在特異性差等缺點。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS法）由于具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點，常用于獸藥殘留的結(jié)構(gòu)確證分析。目前，國外已有不少用LC-MS/MS法測定動物性食品中TCs類藥物殘留的報道，國內(nèi)相對來說起步較晚，報道也不多。本文以牛奶為試材，建立了LC-MS/MS法檢測TCs類藥物殘留的方法，可為牛奶樣品中TCs類藥物的殘留監(jiān)控和監(jiān)督檢驗等提供技術(shù)支持。

4.2 方法的編寫過程

在本方法研制過程中，通過查閱有關(guān)文獻(xiàn)，全面掌握了四環(huán)素類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、藥理毒理作用等，尤其是該類藥物的不穩(wěn)定性：TCs類藥物為金黃色或黃色晶粉，無臭，味苦，遇光色漸變暗，需密封、避光、干燥處保存；易溶于水，但水溶液穩(wěn)定性差，一般均需新鮮配制，可置于低溫下保存；較強(qiáng)酸性環(huán)境（pH值＜2.0）中可降解生成脫水四環(huán)素，弱酸性環(huán)境（pH值2.0～6.0）中可發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素，堿性環(huán)境（pH值＞7.0）下降解生成內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異四環(huán)素。在對該類藥物材料全面掌握的基礎(chǔ)上，參照美國農(nóng)業(yè)部食品安全與監(jiān)督署（FSIS）頒布的己有的檢測方法中前處理方法，針對牛奶的檢測方法進(jìn)行多次實驗，發(fā)現(xiàn)結(jié)果能很好滿足歐盟、美國和我國在制定獸藥殘留檢測方法方面的要求，并通過具體實驗數(shù)據(jù)的實驗，最終確定了該方法的可行性。

4.3 提取條件的確定

由于甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑提取的樣品峰形和靈敏度較差，水溶液的穩(wěn)定性較差，因此在提取時用Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液（pH值=4.0±0.5），這樣既可以利用EDTA絡(luò)合劑與系統(tǒng)內(nèi)的金屬離子進(jìn)行結(jié)合，同時該pH值也能保證該類藥物的穩(wěn)定性，另外在離心過程中溫度控制在15 ℃以內(nèi)，也能防止該類藥物的改變分解。

4.4 凈化條件的確定

本方法使用Oasis HLB固相萃取小柱，使得方法的回收率以及重復(fù)性穩(wěn)定可靠。過柱后洗脫液用氮氣吹干時溫度控制在40 ℃以內(nèi)，殘余物用30%的甲醇水溶液溶解，也能確保其穩(wěn)定性和靈敏度。

4.5 離子對的確定

TCs類藥物屬于歐盟指令96/23/EC附錄ⅠB組所列物質(zhì)，根據(jù)歐盟2002/657/EC要求，要確證該類物質(zhì)，至少需要3 個識別點（IP），因此，實驗中選擇了母離

表2 牛奶中四環(huán)素類藥物的添加回收率結(jié)果

子以及對應(yīng)產(chǎn)生的2 個響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為定性定量的依據(jù)，可以達(dá)到4 個IP點的要求，這樣完全按照違禁藥物對IP點的要求進(jìn)行方法定性分析，可以獲得要求更嚴(yán)格的結(jié)果。

4.6 線性范圍

分別取四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用甲醇稀釋定容成100 μg/mL，再用30%甲醇水溶液稀釋成1 μg/mL的混合標(biāo)液，依次取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL于10 mL容量瓶內(nèi)，用30%甲醇稀釋定容至刻度，制得10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列標(biāo)液，按低濃度到高濃度的順序依次進(jìn)樣，結(jié)果以系列標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出的回歸方程及R2值表明：四環(huán)素、土霉素、金霉素和多西環(huán)素在10～500 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均大于0.990（圖1）。

圖1 四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.7 方法的靈敏度

空白試料按相同的步驟處理后，測定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時間，空白試料對所測分析物無干擾。定量限（LOQ）：進(jìn)行添加濃度為10 ng/g的標(biāo)準(zhǔn)添加時，經(jīng)提取后測定，發(fā)現(xiàn)信噪比S/N＞10（按PtP算），表明方法的定量限為10 ng/g。檢測限（LOD）：進(jìn)行添加濃度為5 ng/g的標(biāo)準(zhǔn)添加時，經(jīng)提取后測定，發(fā)現(xiàn)信噪比S/N＞3（按PtP算），表明方法的檢測限為5 ng/g。

4.8 檢測方法的精密度實驗

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在空白牛奶中添加4 個不同濃度（定量限，低、中、高濃度）的四環(huán)素類藥物進(jìn)行回收率實驗，各濃度進(jìn)行5 個樣品平行實驗，重復(fù)3次，求出批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（表2）。

4.9 McIlvaine-Na2EDTA 緩沖液的配制

對于Mcllvaine-Na2EDTA緩沖液的配制可以采用本方法中的配制方法配制，且每種化合物都使用其帶結(jié)晶水的化合物來稱量配制，使用時要選好帶有多少個結(jié)晶水，如果和標(biāo)準(zhǔn)中的結(jié)晶水的數(shù)量不一致時可以進(jìn)行適當(dāng)折算，然后再配制。

4.10 固相萃取柱的選擇

對于實驗中使用的萃取柱理論上市場上出售的C18柱和HLB柱都能滿足前處理的要求，但在使用C18柱時一定要注意不能在預(yù)洗活化以及上樣過程中出現(xiàn)柱床干涸現(xiàn)象，否則對四環(huán)素類藥物的回收率影響很大，為避免此現(xiàn)象的發(fā)生，最好使用親水親脂的HLB柱子，該柱子柱床是否干涸對回收率基本沒有影響。另外，在使用時考慮到是否容易過柱，可以使用60 mg/3 cc較大規(guī)格的柱子。根據(jù)實際實驗，在處理牛奶樣品時使用60 mg/3 cc的HLB柱子含給前處理過程帶來很大便利。

5 結(jié)論

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)、外標(biāo)法定量測定了牛奶中四環(huán)素類藥物，明確規(guī)定了方法的適用范圍，確定了取樣量、提取凈化方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件等。結(jié)果表明，該方法具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。