劉 蓉 邱 齡* 武海燕 吳晨棟

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院心內科,山西 太原 030001)

維生素D與細胞自噬的相關性及自噬相關基因PTEN的蛋白表達

劉 蓉 邱 齡* 武海燕 吳晨棟

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院心內科,山西 太原 030001)

目的比較維生素D(VD)作用下的老齡大鼠和正常飲食組老齡大鼠肝臟細胞發(fā)生自噬的程度，以探索VD與自噬的關系，同時比較兩組大鼠腎臟組織中自噬相關因子PTEN的蛋白表達。方法將40只24個月老齡雄性SD大鼠隨機分為實驗組和對照組，每組各20只，實驗組大鼠每天經灌胃給予最佳劑量的VD(預實驗得到最佳濃度3.704 μg/kg)，對照組正常飲食。6個月后，活體狀態(tài)下取1 mm3肝臟組織4 ℃保存，100 g肝組織-70 ℃凍存，用透射電鏡觀察各組肝臟細胞自噬泡的數(shù)量；用免疫組化檢測PTEN蛋白表達。結果電鏡下實驗組細胞均出現(xiàn)典型自噬細胞形態(tài)學改變。與正常組相比，VD作用下的大鼠肝臟細胞自噬泡占細胞質總面積的比值均明顯提高(P＜0.01)，免疫組化方法示實驗組細胞PTEN表達較正常組顯著升高(P＜0.01)。結論透射電鏡檢測細胞自噬方法證實VD可增強細胞發(fā)生自體吞噬，同時細胞的PTEN蛋白表達量也相應提高，推測VD引起自噬過程中可能與PTEN有關。

自體吞噬；VD；透射電鏡；免疫組化；PTEN

維生素D(VD)是一種脂溶性維生素，它的活性形式1，25-(OH)2VD3作為激素在人體不同的細胞控制不同的基因表達。有綜述提到VD可能是通過提高自噬從而延緩腫瘤等多種疾病病情，促進人類健康[1]。自噬是真核細胞中一種重要的分解代謝過程，可以降解細胞中受損的大分子物質及細胞器，并可使之再循環(huán)成為細胞所需的能量及基本物質[2]。最近有實驗證明，自噬和大量的疾病有關，特別是腫瘤等疾病的發(fā)生可能都是由于自噬程度的降低[3-4]。自噬相關基因PTEN即磷酸酶與張力蛋白同源物是調節(jié)自噬體形成的關鍵因素[5]。過去都是在病理情況下研究VD與自噬的關系從而起到治療疾病的作用，那么在生理情況下VD是否一樣可以通過誘導自噬而預防疾病。本實驗中我們要觀察在老齡大鼠中VD是否可以增強細胞自噬以及VD引起自噬的轉導通路中是否有PTEN的參與，過去有研究表明提高自噬可以延緩衰老[6]。希望預期結果對衰老具體機制的研究及抗衰老策略的探索提供實驗基礎和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：40只24個月齡健康雄性SD大鼠，體質量320～470 g，由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，隨機分為兩組，即實驗組和對照組，兩組均在普通光照環(huán)境下飼養(yǎng)，飼料為全價顆粒料(主要營養(yǎng)成分：粗蛋白19.31%、粗脂肪2.9%、粗纖維3.1%、水分8.7%、鈣0.5%、磷0.5%)，溫度20～24 ℃，濕度55%～80%，自然光照，飲用自來水，每周換墊料3次。普通飲食洗脫兩周后開始對實驗組進行干預，即每天同一時間經灌胃方式給予實驗組大鼠的VD(經預實驗得到最佳VD濃度)。喂養(yǎng)6個月后，由于大鼠體質量增加2倍，需先用乙醚麻醉，然后再用濃度為1%的戊巴比妥麻醉后暴露肝臟，快速剪下一小塊肝臟組織，在預冷的固定液內于30 s將取下的組織切成1 mm3大小的組織塊，置于2%的戊二醛固定液2 h后緩沖液沖洗后浸泡，4 ℃保存標本備用。切取100 g肝臟組織，-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和儀器：JEM-100CX II型透射電鏡(日本日立HITACHI公司H-600)，超薄切片機(瑞典LKB公司 LKB-Ⅴ)。PTEN兔抗人多克隆抗體購自博士德公司。

1.3 細胞自噬的檢測：透射電鏡觀察肝細胞自噬泡 經過常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片(厚度為50 nm)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后，透射電鏡觀察、拍照、記錄。采用Image-Pro Plus6.0軟件計算電鏡照片中各個細胞中自噬泡占細胞質總面積的比例，用SPSS 17.0對結果進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較進行t檢驗，以α=0.05作為檢驗水準，P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

1.4 免疫組化染色檢測PTEN蛋白表達量

1.4.1 取材與切片準備：動物處死取材，分別取大鼠的腎臟組織置于10.0%甲醛中固定12 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片裱于涂有多聚賴氨酸的清潔玻片上，置80 ℃烤箱1 h，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 正常組 10×103萬倍

圖2 VD組 10×103萬倍

圖3 自噬泡 60×103萬倍

圖4 正常組100倍

圖5 正常組400倍

圖6 VD組100倍

圖7 VD組400倍

1.4.2 主要試劑：小鼠抗人單克隆抗體pten為一抗，生物素化馬抗小鼠IgG為二抗，均購自北京博士德公司；免疫組化試劑盒購和顯色劑DAB均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4.3 步驟：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，放置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐中高火4 min，低火8 min修復抗原滴加雙氧水溫浴10 min，用正常山羊血清封閉液孵育10 min中和非特異性抗原，再將切片滴加1∶50一抗溶液溫浴1 h，4 ℃過夜，最后，將切片依次用生物素標記馬抗小鼠IgG和辣根酶標記鏈霉卵白素工作液孵育各30 min，DAB染色2 min切片中PTEN表達蛋白陽性區(qū)域顯色為棕黃色至棕褐色。

1.5 圖像分析：將免疫組化切片經數(shù)碼顯微攝像后輸入計算機，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組免疫組化染色陽性區(qū)的平均光密度值，光密度與染色強弱呈正比，用SPSS 17.0對結果進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較進行t檢驗，以α=0.05作為檢驗水準，P＜0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 電鏡觀察：透射電鏡下正常組肝臟細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核圓形，核內染色質分布均勻，核仁明顯；肝臟細胞內脂滴較多，線粒體嵴結構清晰，粗面內質網分布在細胞質內，自噬溶酶體少見(圖1)，作用VD的實驗組肝臟細胞結構清晰，細胞核圓形，核內染色質輕度邊集，細胞質內線粒體豐富，線粒體輕度腫脹，體積增大，內質網擴張，自噬溶酶體最多(圖2)自噬泡為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞質成分或廢棄的細胞器經消化降解后形成的板層樣結構(圖3)。

2.2 自噬泡占細胞質總面積的比值：經Image-Pro Plus6.0軟件計算各組細胞電鏡照片中自噬泡占胞質總面積的比例結果顯示：VD作用下的實驗組(0.0487±0.0044)均較正常組(0.0091±0.0025)明顯增加(表1)。

表1 各組細胞中自噬泡占胞質總面積的比值(,n=18)

表1 各組細胞中自噬泡占胞質總面積的比值(,n=18)

注:與正常組比較,*P＜0.01

組別 正常組 VD組比值 0.0091±0.0025 0.0487±0.0044*

2.3 免疫組化染色結果：pten在兩組腎臟中均有表達(圖4～7)，但兩組間的PTEN蛋白表達均有差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。VD作用下的實驗組(0.406±0.098)均較正常組(0.0168±0.078)明顯增加(表2)。

表2 正常飲食組與VD組PTEN的表達(光密度值 ,n=18)

3 討 論

在過去100年中，國內外對VD在鈣磷代謝方面的研究已經很透徹。因為VD可以經紫外線照射在體內生物合成，所以有人提到人們可以通過每天長時間日曬來增加體內的VD水平，但發(fā)現(xiàn)紫外線損傷皮膚并增加皮膚癌，由此開始質疑VD的作用。后來研究發(fā)現(xiàn)這是因為紫外線中的長波可以破壞人體血液中的維生素D，短波紫外線對人體的傷害很大，短時間照射即可灼傷皮膚，長期或高強度照射還會造成皮膚癌，只有中波能促進體內礦物質代謝和維生素D的形成，從中我們得到對皮膚的損害與短波紫外線有關，與產生VD的中波紫外線無關。所以我們可以通過服用VD增加體內VD水平從而彌補了長時間高強度日曬破壞皮膚的不足。最近10年，通過細胞、分子生物及基因等多方面更精細的研究發(fā)現(xiàn)VD的活性形式1，25-(OH)2VD3作為一種多效型激素在人體許多不同的細胞中調控著將近900多種不同的基因表達并調控它們的增殖、分化與存活，它對人類健康的作用開始漸漸浮現(xiàn)。許多流行病學數(shù)據(jù)表明1，25-(OH)2VD3及其類似物除能治療與鈣有關的預防或治療疾病(如佝僂病，軟骨病，骨質疏松癥和甲狀旁腺功能亢進癥)外，也延緩許多其他疾病包括牛皮癬，以及某些類型的癌癥傳染病(如肺結核，慢性肝炎)，心血管和神經系統(tǒng)疾病[7-11]。Mathiasen等第1次通過VD及其類似物EB108對腫瘤細胞的抑制增殖和分化作用的研究推測在腫瘤細胞中VD可以通過提高自噬而延緩病情[12]。Ordonez-Moran等在研究VD和腫瘤關系中推測二者之間可能與自噬有關[13]。對于VD和結核病的研究已有很久的歷史，但Yuk等在2009年第1次證實1，25-(OH)2VD3是通過自噬而治療結核病，而并非人們原先設想的是通過鈣化結核灶而治療結核病。此外，生理條件下相關濃度的1，25-(OH)2VD3誘導單核細胞和巨噬細胞的自噬現(xiàn)象表明自噬現(xiàn)象并不局限于腫瘤，可能在生理條件下誘導自噬[14]。

細胞自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器的共同機制[15]。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細胞環(huán)境穩(wěn)定，這一過程在細胞清除廢物、結構重建、生長發(fā)育中起重要作用。目前許多學者提出飲食限制延緩衰老的效果可能與細胞自噬有關。國內并有實驗證明自噬確實可以延緩衰老。

PTEN是至今發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙特異磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23.3，全長200 kb，由9個外顯子和8個內含子組成，編碼403個氨基酸組成的蛋白質。PTEN可通過促進自噬體的形成在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[16]。它是自噬的信號轉導通路中重要的相關基因，是自噬的正向調節(jié)分子，它可以以通過催化PIP3向PIP2的轉化來抑制AKT的活性，從而解除classIPIK3/PKB途徑對自噬的抑制[17]。最近有實驗證明有些藥物在影響細胞自噬過程中，可以影響到PTEN的蛋白表達[18]。

基于以上研究，在腫瘤、肺結核等疾病中，VD均是通過自噬而延緩及治療疾病的。明確過去的研究資料主要是在病理狀態(tài)，那么對于正常的老年人群，適當劑量的VD是否一樣可以在生理條件下通過細胞自噬而延緩衰老，目前并沒有相關研究報道。為此我們設計了本實驗，通過給予實驗組老齡大鼠最佳劑量的VD，對照組正常飲食，6個月后，比較實驗組和對照組的自噬程度及PTEN的蛋白表達，實驗證實服用VD組大鼠較正常組相比肝臟細胞發(fā)生自體吞噬的程度明顯增強，PTEN蛋白表達也明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義，結果表明VD可以誘導細胞自噬，其機制可能是通過PTEN參與的信號轉導途徑來誘導細胞自噬。這為VD的延緩衰老的效果和細胞自噬的具體機制提供了有關實驗依據(jù)。為以后延緩衰老及預防衰老相關疾病的發(fā)生有著重要的意義。

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Effect of Vitamin D on Autophagy and Expression of PTEN

LIU Rong, QIU Ling, WU Hai-yan, WU Chen-dong
(Department of Cardiology, Second Hospitul of Shanxi Medical University ,Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo probe into the relationship between vitamin D(VD)and autophagy by comparing two groups which are VD group and normal diet group of older rats liver’s autophagy level, meanwhile compare the expressions of the autophagy-related factor PTEN of kidney between the two groups.Methods24-month-aged rats were randomly grouped into two groups -control group(normal dieting), experimental group(the appropriate VD by gavaging)with 20 rats in each group. After six months, get liver tissues by autopsy, then make 1 mm3liver stored at 4 ℃ meanwhile 100 g liver tissues at -70 ℃. To detect the amount of autophagic vacuoles in liver cell by TEM(transmission electron microscope); using immunohistochemical staining method to detect the expression of PTEN.ResultsTypical morphological changes of autophagy can be seen in cell. Compared with control group, the ratio of the amount of autophagic vacuoles to that of total cytoplasm in experimental group increased significantly(P＜0.01), PTEN in experimental group increased significantly(P＜0.01).ConclusionThe detection methods prove that VD can enhance the probability of autophagy in cells, Meanwhile the result that PTEN expression varied with the extension of autophagy, indicate that the autophagy induced by VD maybe related to PTEN.

Autophagy; VD; Transmission electron microscopy; Immunohistochemical; PTEN

R363

B

1671-8194（2015）05-0001-03

山西省自然基金資助項目(2010011054-2)

*通訊作者