劉開泰 陸妙珍 褚宇東

TFF1在肺癌中的表達(dá)及作用研究

劉開泰 陸妙珍 褚宇東

目的 研究三葉因子1（TFF1）在肺癌組織及肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)、甲基化狀態(tài)及其功能。方法選取98例非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)切除的肺癌組織，采用RT-PCR、MSP檢測TFF1在肺癌組織中的表達(dá)與甲基化狀態(tài)，分析其與患者臨床特點(diǎn)的相關(guān)性，以及檢測肺癌細(xì)胞株H23、H1299、L78、H446、H157及95D中TFF1的表達(dá)和甲基化狀態(tài)以及5-aza-2'-deoxycytidine（DAC）處理后細(xì)胞株中TFF1表達(dá)的變化。TFF1轉(zhuǎn)染H23細(xì)胞株，MTT法及克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測其增殖能力和克隆能力的變化，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)及Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase3表達(dá)水平。結(jié)果TFF1在肺癌組織中的甲基化率為56．1%（55/98）。TFF1甲基化與肺癌患者的TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0．001）。TFF1在H23和H157中無表達(dá)，在H1299、H446及95D中表達(dá)較低，在L78中表達(dá)較高。DAC處理后，細(xì)胞株TFF1表達(dá)的變化分別為表達(dá)恢復(fù)（H23、H157），表達(dá)增強(qiáng)（H1299，H446，95D）和無明顯改變（L78）?；謴?fù)表達(dá)TFF1后，H23細(xì)胞株的增殖及克隆形成能力明顯減弱（P＜0．05），細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Caspase3活性片段的表達(dá)明顯增加。結(jié)論TFF1在肺癌組織中的甲基化狀態(tài)與肺癌的TNM分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TFF1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控。肺癌細(xì)胞株H23中恢復(fù)表達(dá)TFF1可以抑制其增殖和克隆能力，促進(jìn)其凋亡。

TFF1 肺癌 DNA甲基化 表觀遺傳學(xué)

1 材料和方法

1.1 人組織標(biāo)本及細(xì)胞系 98例肺癌及癌旁組織來自寧波李惠利醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的肺癌患者，其中Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期60例。癌旁標(biāo)本為距離腫瘤5cm遠(yuǎn)的肺組織，標(biāo)本獲取后立即放置到液氮中保存。肺癌細(xì)胞系H23、H1299、L78、H446、H157及95D，均購自ATCC，37℃，5%CO2孵箱中復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代。

1.2 DAC（5-aza-2′-deoxycytidine）處理 肺癌細(xì)胞系（H23、H1299、L78、H446、H157、95D）在處理前12h以低濃度（30%融合度）重鋪于培養(yǎng)皿中，之后細(xì)胞用DAC（美國Sigma公司）處理，DAC終濃度為2 μmol/L，每24h換液，加藥滿96h收集細(xì)胞RNA。

1.3 提取RNA及 RT-PCR 采用Trizol（美國Life Technologies公司）法提取細(xì)胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)鑒定RNA的質(zhì)量及濃度。提取的RNA在-80℃保存。5μg總RNA用來逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并稀釋到100μl，取2.5μl稀釋后cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)（25μl體系）。TFF1基因PCR引物序列如下：上游引物5′-CTGTTTCGACGACACCGTTC-3′，下游引物5′-TCTGGGACTAATCACCGTGC-3（華大基因），產(chǎn)物長度155bp，35個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參：上游引物：5′-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′（華大基因），25個(gè)循環(huán)。

1.4 DNA提取及硫化 冷凍標(biāo)本迅速研磨后于加有蛋白酶K的DNA提取液TES中消化過夜，用酚氯仿法抽提，100%乙醇沉淀，75%乙醇洗2遍，TE稀釋后分光光度計(jì)測定DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?μg DNA溶于50μl水中，50℃金屬浴中重亞硫酸鹽處理16h，DNA樣本應(yīng)用Wizard DNA Clean-Up系統(tǒng)純化回收，氫氧化鈉脫磺酸處理，乙醇洗滌后溶于20μl水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 MSP（methylation-specific PCR） MSP引物：U（非甲基化引物）：上游引物5′-TGGGTTTTGGTTAGGGTGTT-3′,下游引物5′-CTCATCCCTAACTCAAAATCA-3′，產(chǎn)物長度123bp，35個(gè)循環(huán)；M（甲基化引物）上游引物5′-TGGGTTTCGGTTAGGGTGTC-3′,下游引物5′-CTCATCCCTAACTCGAAATCG-3′，產(chǎn)物長度123bp，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)MSP分析都包括一個(gè)陽性對(duì)照[體外甲基化DNA（IVD）]和一個(gè)陰性對(duì)照（正常人循環(huán)中淋巴細(xì)胞DNA）。MSP結(jié)果在2%瓊脂糖凝膠電泳中分析。

1.6 TFF1和Vector轉(zhuǎn)染H23細(xì)胞 胰酶消化H23細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪6孔板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%?；旌舷♂尩腄NA和稀釋的Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，混合比例（1∶2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量），室溫下保溫20min。將復(fù)合物加入到每孔中，輕輕混勻。37℃，5%的CO2中保溫24h后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，2d后加入篩選抗生素G418，進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.7 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染TFF1和轉(zhuǎn)染Vector滿48h的H23細(xì)胞消化后以2 000個(gè)/孔鋪在96孔板中，分別在0、24、48、72h通過MTT分析方法測定細(xì)胞增殖，每個(gè)時(shí)間段包括5個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀492nm波長處所測定OD值表示。

1.8 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染TFF1和轉(zhuǎn)染Vector滿48h的H23細(xì)胞消化后以500個(gè)/孔鋪在6孔板中，同時(shí)用G418篩選陽性細(xì)胞，每3d換1次液，14d后采用75%冷乙醇固定細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞所形成克隆數(shù)，統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染TFF1和轉(zhuǎn)染Vector滿48h的H23細(xì)胞消化后用PI及Annexin V染色后于流式細(xì)胞儀中測定，分析早凋亡、晚期凋亡細(xì)胞所占細(xì)胞比例，統(tǒng)計(jì)分析其差異。

1.10 Western blot檢測 收集轉(zhuǎn)染TFF1和空載Vector 48h后的H23細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后，立刻加入含有10%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液并置于冰上裂解15min，4℃離心20min收集上清液，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，沸水煮5min后，SDS-PAG膠電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，牛奶封閉2h，一抗（cleaved caspase-3、βactin）室溫孵育2h或4℃過夜后，辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育1～2h，用增強(qiáng)發(fā)光液檢測目的蛋白。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用Kendall相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TFF1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)與DNA甲基化的關(guān)系 RT-PCR檢測顯示TFF1在H23和H157中無表達(dá)，在H1299、H446及95D中表達(dá)較低，在L78中表達(dá)較高。DAC處理肺癌細(xì)胞系后，H23和H157中TFF1表達(dá)恢復(fù)，而H1299、H446及95D中TFF1表達(dá)增強(qiáng)，在L78細(xì)胞中TFF1的表達(dá)無明顯改變。TFF1在肺癌細(xì)胞系H23和H157中呈完全甲基化，在H1299、H446及95D中呈半甲基化，在L78中為非甲基化狀態(tài)（圖1），說明TFF1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)缺失或減低與DNA甲基化相關(guān)。

圖1 TFF1在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)與DNA甲基化的關(guān)系（U：非甲基化；M：甲基化；NL：陰性對(duì)照；IVD：陽性對(duì)照）

2.2 TFF1在肺癌組織中發(fā)生甲基化的頻率 應(yīng)用MSP測定5例正常肺組織及98例肺癌組織中TFF1的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)TFF1在5例正常組織中均為非甲基化狀態(tài)，排除組織特異性，而TFF1在98例肺癌組織中的甲基化率為56.1%（55/98）（圖2）。

圖2 TFF1在肺癌組織中的甲基化狀態(tài)（U：非甲基化；M：甲基化；NL：陰性對(duì)照；IVD：陽性對(duì)照）

2.3 TFF1甲基化與肺癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 TFF1甲基化與肺癌患者的TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.001），同時(shí)TFF1甲基化與肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.001），而與肺癌患者的性別、年齡以及腫瘤分化程度未見顯著相關(guān)性，詳見表1。

2.4 TFF1去甲基化后恢復(fù)表達(dá)與H23細(xì)胞的增殖及克隆形成能力的關(guān)系 TFF1去甲基化后可以明顯的抑制H23細(xì)胞的增殖（P＜0.05）（圖3A），H23細(xì)胞的克隆形成數(shù)在TFF1去甲基化后明顯減少（P＜0.05）（圖3B），說明TFF1的去甲基化可以抑制H23細(xì)胞的增殖及克隆形成能力。

2.5 TFF1去甲基化后恢復(fù)表達(dá)與H23細(xì)胞凋亡的關(guān)系 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TFF1去甲基化后H23細(xì)胞的凋亡率顯著增加（圖4A），Western blot結(jié)果顯示凋亡相關(guān)蛋白Caspase3的活性片段的表達(dá)在TFF1去甲基化后恢復(fù)表達(dá)明顯增加（圖4B），說明TFF1去甲基化可以激活凋亡通路進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡的增加。

表1 TFF1甲基化與肺癌患者臨床特點(diǎn)相關(guān)性分析

圖3 TFF1去甲基化后的恢復(fù)表達(dá)可以抑制H23細(xì)胞的增殖及克隆形成（A：MTT增殖實(shí)驗(yàn)；B：克隆形成實(shí)驗(yàn)）

圖4 TFF1去甲基化后恢復(fù)表達(dá)可以促進(jìn)H23細(xì)胞的凋亡[（A：TFF1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著高于空載（Vector）轉(zhuǎn)染組（P＜0.05）；B：Western blot檢測各轉(zhuǎn)染組蛋白表達(dá)；D1：死亡細(xì)胞；D2：晚期凋亡細(xì)胞；D3：活細(xì)胞；D4：早期凋亡細(xì)胞]

3 討論

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最主要原因之一，其早期診斷率低、病死率高，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1]。近年來越來越多的研究顯示，DNA甲基化是腫瘤中抑癌基因表達(dá)缺失或降低的主要原因之一，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用[8-9]。也有研究顯示表觀遺傳學(xué)的改變，尤其是抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系[10-11]。研究顯示TFF1在多種腫瘤中如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌及上消化道癌的腫瘤形成及其轉(zhuǎn)移相關(guān)[12-15]，而在胃癌中TFF1的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控[16]。已有文章報(bào)道TFF1在肺癌中的表達(dá)及功能[17-19]，但是TFF1在肺癌中的表觀遺傳學(xué)改變及調(diào)控尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，TFF1在肺癌細(xì)胞中存在表達(dá)缺失及表達(dá)降低，經(jīng)過DAC（去甲基化藥物）處理后TFF1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)得到了恢復(fù)，與肺癌細(xì)胞中TFF1的甲基化狀態(tài)相一致，表明TFF1在肺癌中的表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控。在98例肺癌組織中，TFF1的甲基化率高達(dá)56.1%，TFF1在肺癌中呈現(xiàn)高甲基化，并且TFF1的甲基化狀態(tài)與肺癌的TNM分期顯著相關(guān)，提示TFF1的甲基化可作為早期肺癌診斷的潛在標(biāo)志物。在肺癌細(xì)胞系H23中使TFF1去甲基化而恢復(fù)表達(dá)后可以抑制癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，同時(shí)可以激活凋亡通路引起細(xì)胞凋亡的增加，起到抑癌作用。因此，TFF1可作為肺癌治療的潛在靶標(biāo)。

綜上所述，TFF1在肺癌中的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控，TFF1在肺癌中高甲基化與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，使TFF1去甲基化后恢復(fù)表達(dá)可抑制H23細(xì)胞的增殖和克隆形成，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，起到抑癌作用。

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

ObjectiveTo investigate the expression and methylation status of Trefoil factor 1(TFF1)in lung cancer tissues and lung cancer cell lines．MethodsExpression and methylation status of TFF1 in 98 non-small cell lung cancer(NSCLC) tissues and lung cancer cell lines(H23,H1299,L78,H446,H157 and 95D)were detected by RT-PCR and methylation specific PCR(MSP),respectively．The changes of TFF1 expression was also examined after the lung cancer cell lines treated with 5-aza-2'-deoxycytidine(DAC)．After H23 cells were transfected with TFF1 gene,the variation of proliferation and cloning ability of H23 cells was examined with MTT assay and colony formation,respectively．The apoptosis H23 cells was also determined and the expression of Caspase3 was detected with Western blot after transfection．ResultsThe methylation rate of TFF1 in lung cancer tissues was 56%(55/98)．TFF1 methylation was significantly correlated with TNM stage and lymph node metastasis in lung cancer patients(P＜0．001)．There was no expression of TFF1 in H23 and H157 cells,low expression in H1299,H446 and 95D cells,and high expression in L78 cells;after treatment of DAC,the expression of TFF1 was restored(H23 and H157),increased (H1299,H446 and 95D)or not changed(L78)．Transfection of TFF1 decreased proliferation and colony formation,promoted cell apoptosis rate and enhanced expression of Caspase3 in H23 cells．ConclusionThe methylation status of TFF1 in NSCLC tissue is closely related to TNM stages and metastasis of lung cancer．The expression of TFF1 in lung cancer is associated with DNA methylation．Restoration of TFF1 expression in lung cancer cells may suppress cell proliferation and accelerate cell apoptosis．

TFF1 Lung cancerDNA methylation Epigenetic

315040 寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院放療科（劉開泰、陸妙珍），腎內(nèi)科（褚宇東）

劉開泰，E-mail:lkt1982@126.com系統(tǒng)上皮中[4]。研究表明，TFF1在胃癌中起抑癌作用，TFF1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控[5]。TFF1與黏蛋白核心蛋白相互作用以穩(wěn)定胃黏膜表面黏液凝膠層，對(duì)胃黏膜起保護(hù)和再生作用[6]。也有研究顯示，TFF1表達(dá)與多種腫瘤如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌及上消化道癌的形成及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。因此，本文通過研究TFF1在肺癌中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制，探討其在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為肺癌的臨床診治提供參考。

2014-08-15）

肺癌是全球常見惡性腫瘤并且是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。盡管傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)和影像學(xué)檢測在肺癌的診斷中能起重要作用，但仍有67%的新診斷肺癌患者已經(jīng)到了肺癌的較高階段[2]。肺癌的發(fā)生是一個(gè)多相的過程，包括遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)的改變，其中DNA甲基化起到了重要的作用。抑癌基因的甲基化與表觀遺傳現(xiàn)象中的基因沉默密切相關(guān)[3]。尋找發(fā)生于啟動(dòng)子區(qū)甲基化的新功能基因是目前肺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，有助于理解肺癌發(fā)生過程中腫瘤抑制通路的分子機(jī)制，同時(shí)有助于找到肺癌的潛在診斷及治療靶標(biāo)。三葉因子（trefoil factor，TFF）家族是一組蛋白酶抵抗的肽段，包括TFF1、TFF2以及TFF3，均廣泛表達(dá)于消化