張眉+辛相啟+吳斌+王升吉+郭霞+趙玖華

摘要：為明確山東地區(qū)葡萄霜霉病菌株的致病性及親緣關(guān)系，本研究以不同抗性的6個葡萄品種作為鑒別寄主，采用葉盤接種法，對采自山東地區(qū)的13個葡萄霜霉病菌株進(jìn)行致病性測定，并擴增每個菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明，這13個葡萄霜霉病菌株均有致病性，據(jù)致病力分為強、中、弱3種致病類型，中等致病型菌株占優(yōu)勢，菌株間致病力差異與菌株的地域來源無明顯相關(guān)性序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，這13個葡萄霜霉病菌株的親緣關(guān)系很近，rDNA-ITS序列同源性高達(dá)99.94%，菌株間致病力差異與rDNA-ITS序列多態(tài)性不相關(guān)。

關(guān)鍵詞：葡萄霜霉病菌；致病力分化；rDNA-ITS；親緣關(guān)系；山東

中圖分類號：S436.631.1+9文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2015）04-0095-05

葡萄霜霉病是一種世界性病害，在我國已遍布各葡萄產(chǎn)區(qū)，可導(dǎo)致年減產(chǎn)30%～50%[1]。葡萄霜霉病菌[Plasmoparaviticola（Berk.&Curt.）Berl.&deToni]的致病力是否存在分化在國內(nèi)外的研究中一直存有分歧。劉旭等[2]研究表明來自重慶和陜西2個地區(qū)的葡萄霜霉病菌致病力沒有顯著差異；Boubals[3]卻發(fā)現(xiàn)不同來源的葡萄霜霉病菌可以表現(xiàn)出不同的致病力。目前由東葡萄霜霉病菌的致病力分化研究還未曾有報道，因此，本研究將采自山東地區(qū)13個不同霜霉病菌株接種于6個不同抗性葡萄品種進(jìn)行致病性測定，以明確葡萄霜霉病菌的致病性特點，為該病菌的致病機制及病害流行規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

收稿日期：2014-12-01

基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201203035）

核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internaltranscribedspace，ITS）因在真核生物種內(nèi)相對保守，種間差異顯著，常用于真菌物種的分類鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。賈姝等[4]利用rDNA-ITS序列分析發(fā)現(xiàn)，遼寧地區(qū)不同葡萄霜霉病菌株間具有一定的遺傳分化；張勝菊等[5]分析了大白菜與甘藍(lán)寄生霜霉菌的rDNA-ITS序列，表明兩者均與甘藍(lán)型油菜霜霉病菌有較近的親緣關(guān)系。本研究從分子水平上對山東不同葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行比較分析，對探明該病菌的親緣關(guān)系等遺傳進(jìn)化研究有重要意義。

1材料與方法

1.1供試材料

在山東地區(qū)采集的13個不同葡萄霜霉病菌株，見表1。

供試鑒別寄主為6個不同抗性的葡萄品種，分別是摩爾多瓦、夏黑、赤霞珠、玫瑰香、貴妃玫瑰和紅提。

1.2生化試劑及其他

EasyTaq酶購自北京全式金公司，DNA凝膠回收試劑盒購自上海Sangon，其他常規(guī)化學(xué)藥品為分析純試劑。PCR引物合成和DNA測序均由上海Sangon完成。

1.3葡萄霜霉病菌的室內(nèi)接種

1.3.1接種物與寄主植物的準(zhǔn)備從田間采集新鮮的葡萄霜霉病葉，在流水下用毛筆刷掉病斑上老的霉層，將病葉放于人工氣候培養(yǎng)箱中，22℃、相對濕度（RH）90%、光照黑暗各12h交替培養(yǎng)，待長出新的白色霉層時，取孢子囊梗及孢子囊至無菌水中，充分吸打后，將孢子囊懸浮液濃度稀釋至1×105個/mL，用于接種。

選取葡萄當(dāng)年生枝條自上向下第3～4節(jié)位健康無病葉片，清水洗凈后，用內(nèi)徑15mm的打孔器打取葉盤。在直徑90mm培養(yǎng)皿底鋪1層濾紙，加入2mL無菌水，將葉盤葉背朝上放入培養(yǎng)皿中，每皿隨機放入10個葉盤作為1個重復(fù)，每個菌株每個寄主品種重復(fù)3次。

1.3.2接種及病情調(diào)查采用葉盤接種法接種。用微量移液器吸取稀釋好的孢子囊懸浮液滴加在葉盤中央，每個葉盤接種20μL。清水作對照。接種后，將培養(yǎng)皿放于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，22℃、RH90%、光照黑暗各12h交替培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后，用吸水紙吸去葉盤上的接種液，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。接種7d后，計算各處理的病情指數(shù)。利用DPS軟件中的系統(tǒng)聚類，采用卡方距離法計算各處理間的聚類距離，用離差平方和法進(jìn)行聚類分析[6]。

相關(guān)計算方法及標(biāo)準(zhǔn)劃分為：（1）發(fā)病率（%）=（發(fā)病葉盤數(shù)/總?cè)~盤數(shù)）×100。（2）參考劉旭等[2]的研究劃分病情分級標(biāo)準(zhǔn)，并稍加改動：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉盤面積5%以下；3級，病斑面積占葉盤面積5%～20%；5級，病斑面積占葉盤面積20%～50%；7級，病斑面積占葉盤面積50%以上。病情指數(shù)=∑（各級發(fā)病葉盤數(shù)×相對級值）/（調(diào)查總?cè)~盤數(shù)×7）×100。（3）抗性類型：高抗（HR），病情指數(shù)為0～5.0；抗?。≧），病情指數(shù)為5.0～25.O；感?。⊿），病情指數(shù)為25.0～50.0；高感（HS），病情指數(shù)為50.0～100.0。

1.4葡萄霜霉病菌基因組的提取

取1.5mL離心管，加入適量的95%乙醇，用尖頭鑷子夾取新鮮的葡萄霜霉病菌孢子囊梗及孢子囊于乙醇中，4000r/min離心10min，去上清液，收集霜霉病菌。參考穆春華等[7]的方法提取葡萄霜霉病菌的基因組DNA。

1.5葡萄霜霉病菌rDNA-ITS序列的擴增與分析

以葡萄霜霉病菌基因組DNA為模板，用引物ITS1F：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'擴增rDNA-ITS序列。PCR擴增條件為94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min20s，35個循環(huán)；72℃終延伸10min。切膠回收目的片段，送測序公司測序。

通過DNAMAN軟件和Clustalx1.83軟件對rDNA-ITS序列進(jìn)行比對，利用MEGA5.0分析軟件中的Neighbor-Joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。endprint

2結(jié)果與分析

2.1不同葡萄霜霉病菌株的致病力

通過葉盤接種法將13個不同葡萄霜霉病菌株分別接種在6個鑒別寄主葡萄上，對菌株的致病性進(jìn)行測定。接種7d后，發(fā)病嚴(yán)重的可在葉盤接種處出現(xiàn)較大病斑，并有大量白色霉層產(chǎn)生（圖1A）；發(fā)病輕者沒有病斑或僅可見褐色侵染點，極少或不產(chǎn)生白色霉?fàn)钗铮▓D1B）。從表2可以看出，供試13個葡萄霜霉病菌株均有致病性。但是，當(dāng)13個菌株同時接種抗病性較強的夏黑品種時，從病情嚴(yán)重度來看，接種JYrf和BZdd的病指僅為0.48，而接種JYsg.DZln、DZhw和DZSdyj的病指卻都達(dá)到50.00以上；從抗性反應(yīng)來看，出現(xiàn)了高感、感病、抗病和高抗4個類型。接種高抗病品種摩爾多瓦也表現(xiàn)出了相似的發(fā)病特點。同時，當(dāng)寄主為感病性較強的貴妃玫瑰和紅提品種時，病指范圍分別為28.57～79.05和27.62～77.62，病指差均在50左右。由此可以得出，山東葡萄霜霉病菌株間存在著明顯的致病力分化。

對供試菌株的致病力進(jìn)行聚類分析，可以看出（圖2），13個菌株大致可聚為3組，第1組是致病力較強的菌株，為DZhw、DZln、JYsg和DZS-dyj，占30.8%；第Ⅱ組是致病力中等的菌株，為JNzg、XTyjz、MYxz、DZSdt、PYwt和QDnlk，占46.2%；第Ⅲ組是致病力較弱的菌株，為JYrf、BZdd和DYmt，占23.1%。因此，將13個菌株可劃分為強、中、弱3種致病類型，其中，中等致病型菌株為優(yōu)勢菌株。

從圖2還可以看出，JYrf的致病力最弱，而同樣是采自濟陽縣的JYsg致病力最強，所以，地域來源很近的菌株可以表現(xiàn)為不同的致病型；同時地域來源較遠(yuǎn)的菌株JNzg、MYxz和QDnlk又可以聚在一起，均為中等致病型。因此，山東葡萄霜霉病菌致病力差異與菌株的地域來源無明顯相關(guān)。

2.2供試葡萄霜霉病菌株的親緣關(guān)系

對13個葡萄霜霉病菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行Blast比對分析，結(jié)果顯示，所有菌株與登錄號為DQ665668.1的葡萄霜霉病菌高度同源，同源性均為99%。因此，這13個霜霉菌株與已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的親緣關(guān)系很近，屬于同一個種。進(jìn)一步比對發(fā)現(xiàn)，13個菌株間的同源性可高達(dá)99.94%，其中，JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的同源性為100%，DZln和QDnlk有4個堿基位點發(fā)生變異，其他菌株有1～3個堿基變異位點。由此可以得出，采自山東地區(qū)的13個葡萄霜霉病菌株之間的親緣關(guān)系很近，但rDNA-ITS序列間仍然存在一定差異。

根據(jù)以上序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從樹形結(jié)構(gòu)可以看出（圖3），JYrf、DZSdyj、DYmt、PYwt、MYxz和DZhw與已知葡萄霜霉病菌DQ665668.1的親緣關(guān)系最近，聚在同一分支內(nèi)，同源性為99.98%。同為來自青島地區(qū)的DZSdyj、DZSdt和QDnlk菌株分散地聚在了不同的分支中。由此可以得出，葡萄霜霉病菌株間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與菌株的地域來源無相關(guān)性。

2.3葡萄霜霉病菌株致病力差異與rDNA-ITS序列多態(tài)性的關(guān)系

為了明確葡萄霜霉病菌株間致病力的差異是否與rDNA-ITS序列的差異有關(guān)，對致病力（圖2）及系統(tǒng)發(fā)育（圖3）進(jìn)行了綜合分析，可以得出，在強致病力菌株中，DZhw和DZSdyj的同源性為100%，與JYsg的遺傳距離較遠(yuǎn)，rDNA-ITS序列差異較大；在弱致病力菌株中，JYrf和DYmt的同源性為100%，而BZdd則聚在了其他進(jìn)化分支內(nèi)。即使JYrf、DZhw、DZSdyj、DYmt和MYxz的rDNA-ITS序列完全一致，致病力也表現(xiàn)出了強、中、弱的差異。因此，葡萄霜霉病菌株間的致病力差異與rDNA-ITS序列的多態(tài)性無相關(guān)性。

3結(jié)論與討論

致病性測定是真菌研究中的重要環(huán)節(jié)，可為真菌的遺傳多樣性、致病相關(guān)基因、致病機制等研究提供依據(jù)，因此，病原菌的接種技術(shù)是這些研究的關(guān)鍵所在。本研究發(fā)現(xiàn)，孢子囊在22℃下1h即可萌發(fā)，24h萌發(fā)率約為50%。有研究報道[8.9]，葡萄葉片氣孔對游動孢子具有向性引力，游動孢子釋放后會向氣孔游動，約半小時后停止游動形成休止孢，長出芽管從氣孔侵入。因此，我們選擇剛收集到的新鮮孢子囊用于接種，以利于游動孢子在釋放后迅速游動到氣孔附近進(jìn)行侵染，保證侵染活性及測定結(jié)果可靠性。在前期試驗中對孢子囊的接種濃度也進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)濃度低時侵染率較低，而高濃度更利于發(fā)病，最終選用1×105個孢子囊/mL作為病菌的接種濃度，這也與Polesani等[10]、Díez-navajas等[11]和Liu等[12]在研究中所使用的孢子囊量相近，可以實現(xiàn)較好的發(fā)病效果。

葡萄品種的抗病性不隨霜霉病菌菌源的改變而改變[13]，因此我們在前期室內(nèi)、田間接種試驗的基礎(chǔ)上，挑選出6個不同抗病性且在山東地區(qū)較為普遍種植的葡萄品種作為鑒別寄主。本研究結(jié)果表明，13個葡萄霜霉病菌株均具有致病性，并且存在明顯的致病力分化，由此推測，有不同生理小種的存在，這Boubals[3]的研究發(fā)現(xiàn)相一致。此外，李華[14]的研究結(jié)果也表明，不同霜霉病菌株接種不同抗性葡萄品種，菌株間表現(xiàn)出了致病力差異，但不存在寄主-病原間的特異性互作，由此提出了葡萄與葡萄霜霉菌之間的水平系統(tǒng)學(xué)說，同時，他還認(rèn)為，葡萄霜霉病菌的致病力差異首先表現(xiàn)在其孢子囊大小和其中所含細(xì)胞核數(shù)量的差異，換言之，就是霜霉菌的異核現(xiàn)象引起了致病力的不同[15]。研究中我們還發(fā)現(xiàn)，有些菌株在接種抗病性較強的摩爾多瓦和夏黑時，葉盤上特別是接種點處會出現(xiàn)褐色點狀侵染斑（圖1B），鏡檢發(fā)現(xiàn)這些變色組織主要集中在氣孔周圍，此前有相關(guān)報道認(rèn)為抗病葡萄葉片在受到霜霉菌侵入時會在氣孔周圍形成胼胝質(zhì)沉積物[16]，這一物質(zhì)會穿透寄主細(xì)胞形成一道屏障從而阻止侵染菌絲進(jìn)一步展[9]，同時還會阻斷吸器與寄主細(xì)胞之間的物質(zhì)交換[17]，所以這些侵染斑可能是因胼胝質(zhì)的阻礙使得生長受到局限的霜霉菌引起的癥狀。但相對于出現(xiàn)以上侵染表型的菌株，JYsg、QDnlk和MYxz仍然可以在摩爾多瓦葉盤上長出較多霉層，因此該病菌的致病機理還需進(jìn)一步研究。

目前，rDNA-ITS序列分析在植物病原真菌的分類鑒定、種間親緣關(guān)系研究、植物病原真菌檢測等方面已得到廣泛應(yīng)用。為了弄清這13個葡萄霜霉病菌株的親緣關(guān)系，我們對它們的rDNA-ITS序列進(jìn)行了Blast分析，結(jié)果表明這13個菌株與GenBank中的DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源，同源性均為99%，而且菌株間的同源性可高達(dá)99.94%，差異菌株只發(fā)生了個別堿基位點的變異。這與賈姝等[4]的研究結(jié)果相一致，他們在遼寧地區(qū)采集了21個葡萄霜霉病菌株，這些菌株也都與DQ665668.1葡萄霜霉病菌高度同源，并且菌株間的遺傳距離很近。這些都說明，rDNA-ITS序列在葡萄霜霉病菌的種內(nèi)是非常保守的，這將為該病菌的遺傳進(jìn)化研究提供參考。endprint