梁昊岳，楊晚竹，程雪蓮，王金宏

流式細(xì)胞術(shù)操作軟件在小鼠造血干細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用比較

梁昊岳，楊晚竹，程雪蓮，王金宏

目的：探討流式細(xì)胞術(shù)中不同分析軟件在小鼠造血干細(xì)胞分析中的特點(diǎn)和差異。方法：使用小鼠骨髓細(xì)胞懸液作為實(shí)驗(yàn)材料，在BD AriaIII和BD Influx流式細(xì)胞儀上檢測(cè)小鼠造血干細(xì)胞，分別應(yīng)用FACSDiva、FACSSortware軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并比較分析結(jié)果。結(jié)果：FACSDiva和FACSSortware軟件在參數(shù)調(diào)節(jié)、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、圈門(mén)、數(shù)據(jù)保存和分選設(shè)置方面存在細(xì)微差異，均可以實(shí)現(xiàn)多色流式分析和高速流式分選。結(jié)論：FACSDiva和FACSSortware軟件分析同一樣本所得結(jié)果有較高的一致性，均是使用流式細(xì)胞儀不可或缺的工具。

流式細(xì)胞術(shù)；造血干細(xì)胞；FACSDiva軟件；FACSSortware軟件

0 引言

造血系統(tǒng)的細(xì)胞發(fā)生于骨髓中的一群具有自我更新能力的細(xì)胞，即造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）[1]。造血干細(xì)胞移植是惡性血液疾病的一種重要治療手段，在科學(xué)研究中常利用動(dòng)物模型模擬人體的生理?xiàng)l件來(lái)考察造血干細(xì)胞移植效果，流式細(xì)胞術(shù)在臨床和科研監(jiān)測(cè)移植效果中都發(fā)揮著重要的作用。目前關(guān)于檢測(cè)小鼠骨髓造血干細(xì)胞表型的方法有LSK、SLAM、SP等。Osawa等利用CD34-/lowckit+Sca-1+Lin-組合檢測(cè)小鼠HSC是比較常用的方法。SLAM家族的某些分子，其配體CD150和CD48也是分離小鼠HSC的標(biāo)志。CD48-CD150+是高度富集的造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的標(biāo)志[2-6]。Goodell等定義具有外排染料Hoechst33342的細(xì)胞為側(cè)群細(xì)胞（SP細(xì)胞），用來(lái)篩選小鼠HSC[7-9]。

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠骨髓造血干細(xì)胞，其結(jié)果不僅受樣品固有性質(zhì)、樣品的處理方法和熒光染色的影響，還受流式操作軟件的影響。在實(shí)際工作中，美國(guó)BD公司的BD Aria和BD Influx分別是應(yīng)用最多和最高端的流式細(xì)胞儀，其相應(yīng)的進(jìn)行流式分析和分選操作的專(zhuān)業(yè)軟件分別為FACSDiva和FACSSortware，但是目前對(duì)上述2款軟件使用操作方法的比較尚無(wú)報(bào)道。該研究旨在對(duì)不同流式操作軟件的使用方法進(jìn)行比較，并對(duì)應(yīng)用不同軟件檢測(cè)小鼠骨髓造血干細(xì)胞的分析結(jié)果進(jìn)行比較，希望能對(duì)流式操作軟件的使用有一定借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

BD AriaIII流式細(xì)胞儀，BD Influx流式細(xì)胞儀，Accudrop Beads（美國(guó)Becton Dickinson公司），Rainbow Beads（美國(guó)Becton Dickinson公司），APC-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Lineage抗體，APC標(biāo)記的抗小鼠ckit抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠CD34抗體，PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠Sca-1抗體，PerCP標(biāo)記的抗小鼠CD150抗體，PE標(biāo)記的抗小鼠CD41抗體，1×PBS鞘液，磷酸緩沖液。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

將Rainbow Beads和Accudrop Beads用無(wú)菌鞘液稀釋備用，取小鼠骨髓細(xì)胞，使用流式抗體染色，避光30min后，用2mL磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，離心后重懸于PBS溶液，溶液中細(xì)胞濃度控制在107個(gè)/mL以下，2 h內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式分析。

1.2.2 樣品檢測(cè)

開(kāi)啟BD AriaIII流式細(xì)胞儀，用Rainbow Beads檢測(cè)儀器各通道，應(yīng)用FACSDiva檢測(cè)軟件。在前向角散射光/側(cè)向角散射光（FSC/SSC）散點(diǎn)圖中顯示細(xì)胞群，利用DAPI染料除去死細(xì)胞，調(diào)節(jié)熒光電壓等參數(shù)，記錄總細(xì)胞數(shù)不少于200 000個(gè)。開(kāi)啟BD Influx流式細(xì)胞儀，用Rainbow Beads調(diào)節(jié)光路，檢測(cè)儀器各通道，應(yīng)用FACSSortware檢測(cè)軟件。相同方法調(diào)節(jié)參數(shù)，記錄總細(xì)胞數(shù)不少于200 000個(gè)。

1.2.3 小鼠骨髓造血干細(xì)胞流式分析

分別應(yīng)用FACSDiva和FACSSortware檢測(cè)軟件，對(duì)小鼠骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行流式分析，圈選表型為L(zhǎng)in-CD34-c-kit+sca-1+CD150+CD41-的小鼠骨髓造血干細(xì)胞，分析細(xì)胞群比例。

2 結(jié)果

2.1 FACSDiva和FACSSortware軟件總觀

FACSDiva軟件總觀主要由數(shù)據(jù)獲取、參數(shù)調(diào)節(jié)、流式圖顯示、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、液流顯示、流式分選、數(shù)據(jù)保存等幾個(gè)模塊組成。FACSSortware軟件總觀主要由數(shù)據(jù)獲取、參數(shù)調(diào)節(jié)、流式圖顯示、補(bǔ)償調(diào)節(jié)、流式分選、數(shù)據(jù)保存等幾個(gè)模塊組成。2款軟件都可以完成多激光、多色的流式分析和高速流式分選，二者在總觀方面有如下區(qū)別：

（1）FACSDiva軟件可全屏顯示于2臺(tái)計(jì)算機(jī)顯示器，操作較為方便，顯示空間較大，各模塊顯示可不重疊；FACSSortware軟件只能顯示于單臺(tái)計(jì)算機(jī)顯示器，顯示空間較小，各模塊顯示可能會(huì)有重疊，但節(jié)省成本和空間。

（2）FACSDiva軟件中有流式細(xì)胞儀液流情況界面，顯示為“70 micron”2個(gè)模塊；FACSSort-ware軟件中沒(méi)有這2個(gè)模塊，而是將它們分別單獨(dú)顯示于計(jì)算機(jī)顯示器上方的Drop顯示屏和Stream顯示屏。

2.2 FACSDiva和FACSSortware數(shù)據(jù)獲取模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件數(shù)據(jù)獲取模塊包括數(shù)據(jù)獲取、記錄、刷新、記錄時(shí)間和細(xì)胞個(gè)數(shù)的“Acquire”、“Record”、“Restart/Reset”、“ElapsedTime”、“Rate”選項(xiàng)，二者主要區(qū)別如下：

（1）FACSDiva軟件數(shù)據(jù)獲取模塊包含設(shè)置收集數(shù)據(jù)的“Stopping Gate”和“Storage Gate”；而 FACSSortware將這2個(gè)選項(xiàng)設(shè)置在數(shù)據(jù)保存模塊中。

（2）FACSDiva軟件數(shù)據(jù)獲取模塊包含上樣和調(diào)節(jié)流速的“Load”和“Flow Rate”選項(xiàng)；FACSSortware中沒(méi)有上述2個(gè)選項(xiàng)，上樣和調(diào)節(jié)流速的按鍵和旋鈕被設(shè)置在機(jī)器上，這種設(shè)置適合于FACSSortware的單屏幕顯示方式，將軟件的部分功能安排在機(jī)器中，節(jié)約軟件顯示所需的空間。

2.3 FACSDiva和FACSSortware參數(shù)調(diào)節(jié)模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件參數(shù)調(diào)節(jié)模塊都包括各激光流式通道顯示、電壓調(diào)節(jié)、線(xiàn)性/對(duì)數(shù)方式選擇等選項(xiàng)，二者差別如下：

（1）FACSDiva可以在軟件中刪除不需要的參數(shù)；FACSSortware不能刪除。

（2）FACSSortware可以在參數(shù)調(diào)節(jié)模塊中為各個(gè)通道添加標(biāo)注，以表示這一熒光素連接的抗體；而FACSDiva需要在另外的“Experiment Layout”界面下實(shí)現(xiàn)這一功能。

2.4 FACSDiva和FACSSortware補(bǔ)償調(diào)節(jié)模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件補(bǔ)償調(diào)節(jié)模塊都包括補(bǔ)償調(diào)節(jié)的基本功能，二者差別如下：

（1）作為分析軟件，F(xiàn)ACSDiva只需勾選“Enable Compensation”即可時(shí)刻觀察調(diào)節(jié)補(bǔ)償后的流式圖形變化，而FACSSortware有時(shí)則需要在每次調(diào)節(jié)補(bǔ)償后手動(dòng)點(diǎn)擊“Visualize”才能觀察到流式圖形的變化，這是FACSSortware軟件的一個(gè)小的不便之處。

（2）不同樣本的補(bǔ)償顯示方面，F(xiàn)ACSDiva只需在數(shù)據(jù)獲取模塊選擇“Next Tube”，補(bǔ)償數(shù)據(jù)會(huì)自動(dòng)顯示，而FACSSortware則需依次改變每個(gè)流式圖顯示的樣本數(shù)據(jù)，并在補(bǔ)償調(diào)節(jié)模塊中的“Data Source”選擇相應(yīng)的樣本，才能顯示不同樣本的補(bǔ)償。

2.5 FACSDiva和FACSSortware圈門(mén)顯示方式

2款軟件都可逐級(jí)圈門(mén)，并在等級(jí)圖中顯示。二者的區(qū)別在于：使用FACSDiva軟件圈選子門(mén)時(shí)需在流式圖中點(diǎn)擊右鍵“Show Populations”選擇顯示上一級(jí)門(mén)，再在上一級(jí)門(mén)的基礎(chǔ)上圈選子門(mén)；使用FACSSortware軟件圈選子門(mén)時(shí)需要首先點(diǎn)擊圖標(biāo)，使流式圖顯示上一級(jí)門(mén)，再用鼠標(biāo)左鍵單擊上一級(jí)門(mén)圖標(biāo)，才可以實(shí)現(xiàn)圈選子門(mén)。若未用鼠標(biāo)左鍵單擊上一級(jí)門(mén)圖標(biāo)，則圈選出的子門(mén)在等級(jí)圖中顯示為上一級(jí)門(mén)的平行門(mén)。從圈門(mén)的角度分析，F(xiàn)ACSDiva軟件更為便捷。

2.6 FACSDiva和FACSSortware數(shù)據(jù)保存模塊

2款軟件都可以實(shí)現(xiàn)流式數(shù)據(jù)的按要求保存。二者的區(qū)別在于：FACSDiva軟件需要在獲取數(shù)據(jù)后手動(dòng)將數(shù)據(jù)存儲(chǔ)到目的文件夾中；FACSSortware軟件可將數(shù)據(jù)的獲取和存儲(chǔ)同時(shí)進(jìn)行，節(jié)省了操作時(shí)間。FACSSortware軟件中“FCS File”選項(xiàng)下顯示的即為存儲(chǔ)路徑和文件名，用戶(hù)可以自行選擇。

2.7 FACSDiva和FACSSortware流式管分選模塊

FACSDiva和FACSSortware軟件流式管分選模塊都可實(shí)現(xiàn)高速二路分選和四路分選，并可在軟件中選擇分選模式，單細(xì)胞分選都可選擇“Single Cell”模式。同時(shí)，軟件可以設(shè)置連續(xù)分選和固定細(xì)胞個(gè)數(shù)分選，并能進(jìn)行Accudrop調(diào)節(jié)等[10]。二者的區(qū)別在于：

（1）FACSSortware軟件能夠自動(dòng)避免各路分選細(xì)胞的重疊所造成的邏輯錯(cuò)誤；FACSDiva軟件需要操作者自行判斷分選設(shè)置的門(mén)是否存在邏輯錯(cuò)誤。

（2）FACSSortware軟件通過(guò)設(shè)置每路分選都有控制開(kāi)始和停止的選項(xiàng)，可以實(shí)現(xiàn)在多路同時(shí)分選過(guò)程中停止單一路的分選；FACSDiva軟件只能統(tǒng)一開(kāi)始和停止分選。

2.8 FACSDiva和FACSSortware 96孔板分選模塊

2款軟件都可以實(shí)現(xiàn)96孔板分選等微孔板分選和單細(xì)胞分選。二者的區(qū)別在于：

（1）FACSDiva軟件在單擊“Sort”開(kāi)始分選時(shí)，微孔板會(huì)自動(dòng)移動(dòng)到設(shè)置好的分選位置；FACSSort軟件需要先單擊“Sort Ready”，將微孔板移動(dòng)到設(shè)定的位置。

（2）FACSSort需要用鼠標(biāo)將微孔板中需要分選的區(qū)域選中，使陰影覆蓋這一區(qū)域，才可以順利分選，否則陰影未覆蓋的區(qū)域不能進(jìn)行分選；FACSDiva軟件無(wú)需這項(xiàng)操作，一經(jīng)開(kāi)始即可連續(xù)分選。

2.9 FACSDiva和FACSSortware微孔板位置設(shè)置模塊

2款軟件都可以進(jìn)行微孔板位置調(diào)節(jié)，通過(guò)上下左右箭頭設(shè)置微孔板位置，并單擊“Set Home”確定位置。二者的區(qū)別在于：FACSSortware軟件可以通過(guò)數(shù)字設(shè)定微孔板橫縱坐標(biāo)的位置，這種設(shè)置更為精細(xì)；FACSDiva軟件只能通過(guò)大格或小格的移動(dòng)調(diào)節(jié)微孔板位置，無(wú)數(shù)字化設(shè)置。

2.10 應(yīng)用FACSDiva和FACS Sortware軟件分析小鼠骨髓造血干細(xì)胞流式結(jié)果

圖1（a）和圖1（b）分別為FACSDiva和FACSSortware軟件分析小鼠骨髓造血干細(xì)胞流式結(jié)果。P6門(mén)內(nèi)為小鼠骨髓造血干細(xì)胞，其表型為L(zhǎng)in-CD34-c-kit+sca-1+-CD150+CD41-。FACSDiva和FACSSortware軟件分析小鼠骨髓造血干細(xì)胞群比例分別為 17.3%和17.9%，分析結(jié)果具有較高的一致性。

圖1 應(yīng)用FACSDiva和FACSSortware分析小鼠骨髓造血干細(xì)胞流式結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，流式細(xì)胞儀在血液學(xué)，特別是血液病診斷方面有著較為廣泛的應(yīng)用[11-12]，流式軟件的功能也更加強(qiáng)大，在分析細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用[13-14]。2003年，BD推出了第一臺(tái)FACSAria分析分選型流式細(xì)胞儀。后經(jīng)多次更新?lián)Q代，目前主要使用的為BD FACSAriaⅢ。BD FACSDiva軟件是BD LSR系列、BD Canto系列、BD Aria系列流式細(xì)胞儀通用的流式操作軟件，能有效地支配儀器、獲取及分析數(shù)據(jù)、完成質(zhì)控等。它可以將一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案由一個(gè)平臺(tái)移動(dòng)到另一個(gè)平臺(tái)，給儀器的使用者和維護(hù)者提供了一個(gè)高效、便捷的工具，保證了數(shù)據(jù)的可靠性。BD Influx是當(dāng)今最高端的、可與Beckman Moflo XDP相媲美的流式細(xì)胞分析分選儀。BD FACSSortware軟件提供對(duì)流式細(xì)胞儀的全面控制，從儀器設(shè)置到實(shí)驗(yàn)獲取的補(bǔ)償調(diào)節(jié)、分析和分選，為操作者提供全方位的幫助。由于FACSSortware軟件為單個(gè)顯示器顯示，所以部分功能被設(shè)置在機(jī)器上，如上樣、調(diào)節(jié)流速、顯示液流狀態(tài)等。從使用角度分析，F(xiàn)ACSDiva在參數(shù)設(shè)置、補(bǔ)償調(diào)節(jié)和圈門(mén)方面更加方便，F(xiàn)ACSSortware軟件在數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、自動(dòng)糾正分選中的邏輯錯(cuò)誤、開(kāi)始和停止單一路分選、數(shù)字化調(diào)節(jié)微孔板位置等方面有更多的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ACSDiva軟件和FACSSortware軟件在使用過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)與機(jī)器失去連接或死機(jī)的現(xiàn)象，影響軟件的正常使用。此外，使用FACSSortware軟件存在分選時(shí)有時(shí)不能顯示分選所得細(xì)胞數(shù)、使用96孔板分選時(shí)微孔板不能正確移動(dòng)等問(wèn)題，這些都有待進(jìn)一步改進(jìn)。同時(shí)，F(xiàn)ACSDiva軟件和FACSSortware軟件都應(yīng)增加上樣保護(hù)功能，即當(dāng)樣本接近吸空時(shí)自動(dòng)停止上樣，避免管路內(nèi)進(jìn)入氣泡或液流斷開(kāi)，影響后續(xù)使用。只有不斷改進(jìn)軟件的設(shè)置和功能，提高軟件對(duì)使用者的友好度，軟件才能為更多使用者所接受和掌握，更好地發(fā)揮其應(yīng)有的作用。

綜上所述，該文分析和比較了兩款常用的流式細(xì)胞儀操作軟件和小鼠骨髓造血干細(xì)胞流式結(jié)果，為流式操作軟件的使用提供了借鑒。流式操作軟件是使用流式細(xì)胞儀不可或缺的工具，可以預(yù)見(jiàn)，在不久的將來(lái)，在FACSDiva和FACSSortware軟件的幫助下，BD Aria系列和BD Influx分析分選型流式細(xì)胞儀在臨床和科研領(lǐng)域的應(yīng)用范圍會(huì)更加廣闊、更為深入，不斷為人類(lèi)認(rèn)識(shí)疾病、治療疾病提供幫助和動(dòng)力。

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（收稿：2014-10-06 修回：2014-12-30）

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Comparison of kinds of flow cytometry operation software in mice bone marrow hematopoietic stem cell analysis

LIANG Hao-yue,YANG Wan-zhu,CHENG Xue-lian,WANG Jin-hong
（State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology&Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China）

ObjectiveTo explore the characteristics and differences of kinds of flow cytometry operation software for mice bone marrow hematopoietic stem cell analysis.MethodsWith mice bone marrow cells as experimental materials,cells were stained by antibodies and measured by BD AriaIII and BD Influx flow cytometer.The results of hematopoietic stem cell were analyzed and compared by FACSDiva and FACSSortware software.ResultsDiscrepancies of FACSDiva and FACSSortware involved parameter regulation,compensation regulation,gating,data storage and sorting parameter setting. Both of the softwares were effective to complete multicolor flow analysis and high-speed cell sorting.ConclusionResults of the same sample analyzed by FACSDiva and FACSSortware can obtain high consistency.[Chinese Medical Equipment Journal，2015，36（3）：5-8]

flow cytometry;hematopoietic stem cell;FACSDiva software;FACSSortware software

R318；TP316

A

1003-8868（2015）03-0005-04

10.7687/J.ISSN1003-8868.2015.03.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81001377）

梁昊岳（1987—），男，技師，主要從事流式細(xì)胞測(cè)試方面的工作，E-mail：yueyue_0612@aliyun.com。

300020天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所），實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（梁昊岳，楊晚竹，程雪蓮，王金宏）

王金宏，E-mail：jyuwang@sina.com